PNPTK融合自杀基因系统对肝癌细胞杀伤作用的实验研究
作者：周俊立,蔡晓坤 杨翌 周卫平,王德全 姚振江
【摘要】 目的 分析PNPTK融合自杀基因系统对HepG2肝癌细胞的杀伤作用及其对肝癌细胞的杀伤机制。方法 利用重组PCR定点诱变法制备PNPTK融合基因，将其插入真核表达载体pcDNA3.0中，构建融合基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK，经酶切、PCR及测序鉴定重组体，G418筛选获得稳定转染了pcDNA3.0/PNPTK的抗性细胞克隆。RTPCR和Western Blotting检测PNPTK基因在HepG2细胞中的表达。台盼兰排斥法测定细胞生长曲线，MTT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应。结果 融合基因片段PNPTK正确插入了pcDNA3.0载体中，pcDNA3.0/PNPTK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达。细胞抗性克隆对相应的前药十分敏感。在两种前药的联合作用下，pcDNA3.0/PNPTK对肝癌细胞产生了良好的旁观者效应。结论 具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3.0/PNPTK对肝癌细胞HepG2有着良好的杀伤作用，有望将其应用于肝癌体内治疗。
【关键词】 PNPTK融合基因; 肝癌;基因治疗
Abstract:Objective To investigate the cytotoxic effects of a PNPTK chimeric gene on the basis of PNP suicide gene on HepG2 hepatoma cells and explore the potential mechanism of their killing effects.Methods A fusion suicide gene,PNPTK,was produced by sitedirected mutagenesis technique. And then it was inserted into pcDNA3.0 to construct a vector harboring a chimeric gene,pcDNA3.0/PNPTK. The recombinant was identified by recombinant enzyme,PCR and sequencing. Then it was transfected into HepG2 cells by liposomemediated method. The cellular clone stably transfected with pcDNA3.0/PNPTK was established with G418 selection. The expression of PNPTK gene was also detected by RTPCR and Western blotting method. The growth curve of cellular clone was determined by trypan blue exclusion test. The sensitivity of the cell clone to its corresponding prodrugs and the caused bystander effects were assayed by MTT method.Results The PNPTK fusion gene was inserted into pcDNA3.0 successfully,and its stable expression in HepG2 cells was confirmed. The cellular clone with the stable expression of PNPTK gene was sensitive to its corresponding prodrugs,MePdR and GCV. It was demonstrated that the bystander effects derived from pcDNA3.0/PNPTK after the synergetic treatment of MePdR and GCV were mighty.Conclusion The killing effects of the bifunctional suicide gene vector,pcDNA3.0/PNPTK,on hepatoma cells are satisfactory. It was promising to apply pcDNA3.0/PNPTK to gene therapy for hepatoma in vivo.
Key words:PNPTK chimeric gene;Hepatoma;Gene therapy
单自杀基因系统治疗肿瘤易引起肿瘤耐药性，又存在着对特定细胞类型的依赖性。融合自杀基因产物兼具两种自杀基因的功能，使两种自杀基因产生协同作用，从而既克服了细胞类型依赖性，又减少了肿瘤细胞对药物的耐药性，提高了这一疗法的实用性。本实验将一种新型自杀基因系统——大肠杆菌嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)/6甲基嘌呤脱氧核糖核苷(MePdR)系统[1]与目前已广泛应用的单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶(MePdR)/GCV[2]系统相结合，构建融合自杀基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK，筛选出稳定表达PNPTK基因的抗性细胞克隆，经旁观者效应证实融合自杀基因PNPTK对于肝癌细胞的杀伤作用。结果显示，在两种前药协同作用的情况下，pcDNA3.0/PNPTK对肝癌细胞显示出良好的杀伤作用。
1 材料
1.1 细胞株 肝癌细胞株HepG2购自武汉中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。
1.2 质粒与菌株 真核表达载体pcDNA3.0购自Invitrogen公司，携PNP基因质粒pTyrPNP2美国Pittsburgh 大学David Barlett教授惠赠，含MePdR基因载体pⅡ1.5tk由美国Emory大学ChiaLing Hsieh教授赠送。大肠杆菌DH5α菌株由本所保存。
1.3 主要试剂与药品 实验所用限制性内切酶、T4DNA连接酶、高保真Taq酶、DNA片段回收试剂盒以及质粒纯化试剂盒均购自Takara公司。 G418、胎牛血清、DMEM培养基、MePdR购自GIB/BRL公司;总RNA提取试剂盒Trizol、脂质体Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司;MMLV逆转录酶、Rnasin(RNA酶抑制剂)购自Promega公司;G418、6MP、台盼兰(Trypan blue)、MTT购自Sigma公司;GCV由华中科技大学同济医学院药理教研室吴健鸿博士赠送。兔抗MePdR的多克隆抗体由本所免疫室制备，羊抗兔IgGAP购自华美生物工程公司。大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。
1.4 引物 由上海博亚生物工程公司合成。引物中含相应酶切位点。融合基因起始密码子前掺入Kozak序列[3]。
2 方 法
2.1 融合基因表达载体pcDNA3.0/PNPTK的制备与鉴定融合基因的制备根据本实验室方法并参照文献方法[4,5] (图1)。
2.2 各基因在细胞中的表达
抗性细胞克隆的筛选方法和步骤详见文献[5]，筛选获得细胞抗性克隆HepG2/PNPTK;融合基因表达检测方法和步骤参见精编分子生物学指南[6]。
2.3 细胞生长曲线的测定
按2×103/孔接种各细胞于96孔板，每种细胞平行接种4孔。各细胞均在37 ℃、φ=5%2、饱和湿度条件下进行培养。每隔24 h每种细胞各取1孔，胰酶消化，台盼蓝计数活细胞，取其平均值作生长曲线。
2.4 细胞对前体药物敏感性
以2×103/孔接种细胞于96孔板，每个浓度设4复孔。37℃、φ=5%CO2培养至细胞80%融合，更换含不同浓度相应前药的培养液。继续培养96 h，加入MTT溶液，20 μL/孔(5 mg/mL)，继续孵育4 h。终止培养，弃上清，加入DMSO(100 μL/孔)，酶联免疫检测仪上测定各孔490 nm波长A值。细胞存活率=A实验组/A对照组×100%。
2.5 旁观者效应[ 7]
将HepG2细胞与HepG2/PNPTK细胞配制成1∶1的混合细胞悬液，每组设4复孔。37 ℃、φ=5%CO2培养至细胞80%融合，再更换含IC50浓度前药(7 μmol/L MePdR+0.07 μmol/L GCV)的培养液，继续培养。视细胞生长状况，添加含相应前药的新培养液，原培养基不吸弃。8 d后终止培养，MTT法测定活细胞数。
2.6 统计学处理
采用单因素方差分析，两组间差异比较采用t检验，用SAS6.12 for Windows软件进行统计学分析。