叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白对肿瘤细胞的毒性及靶向性研究
作者：张武雄,凌丽,何练芹,臧林泉,潘雪刁,朱亮
【摘要】 目的 研究叶酸偶联5氟尿嘧啶白蛋白在体外对肿瘤细胞的毒性及经叶酸受体介导的靶向性。方法 选用叶酸受体表达阳性FR(+)宫颈癌HeLa细胞及叶酸受体表达阴性FR(-)肺癌A549细胞进行实验。用MTT法观察叶酸偶联物对细胞的毒性作用,同时利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理，考察叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。结果 叶酸偶联物对FR(+)HeLa细胞具有比5氟尿嘧啶原料药更高的抑制率,能有效的靶向FR(+)HeLa细胞,且细胞毒性作用能被过量的外源性游离叶酸所抑制,而叶酸偶联物对FR(-)A549细胞作用很弱。结论 叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白能经叶酸受体介导靶向于叶酸受体丰富的肿瘤细胞。
【关键词】 叶酸偶联;5氟尿嘧啶;细胞毒性;靶向性
Abstract:Objective To study the cytotoxicity and targeting ability of folateconjugated 5fluorouracilalbumin via folate receptormediated endocytosis on tumor cells in vitro.Methods The folate receptor positive FR(+) HeLa cell and FR() lung A549 cell were used for experiment. The cytotoxicity of the folateconjugate on tumor cells was measured by MTT assay. According to the competitive inhibition principle and due to that free folate had high affinity for folate receptor,free folic acid was used to validate whether folateconjugate has the targeting ability to FR(+) HeLa cell via folate receptormediated endocytosis.Results The cytotoxicity of folateconjugate to FR(+) HeLa cell was stronger than 5fluorouracil crude drug in the same concentration,and could be inhibited by excess free folic acid,while the cytotoxicity on FR(-) lung A549 cell was very weak. Conclusion Folateconjugated 5fluorouracilalbumin could be targeted into tumor cells with rich folate receptors via folate receptormediated endocytosis significantly.
Key words: folateconjugated; 5fluorouracil; cytotoxicity; targeting
目前,肿瘤细胞叶酸受体受到广泛关注,已成为肿瘤诊断和治疗研究的新靶点[1-4]。国内外研究都证明了利用叶酸对受体的高度亲和性,可将药物-叶酸偶联物经叶酸受体介导靶向到高度表达该受体的肿瘤细胞(如鼻咽癌、宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌等),这些肿瘤细胞膜表面上的叶酸受体活性和数量显著高于一般正常细胞[5-8],这为叶酸受体介导药物靶向于肿瘤细胞的研究奠定了基础。据此,本研究以叶酸为靶向基团合成了叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白,采用MTT法[9]观察叶酸偶联物对肿瘤细胞的毒性作用,利用游离叶酸能与叶酸偶联物竞争性结合叶酸受体的原理,验证该叶酸偶联物是否具有经叶酸受体介导的靶向性。
1 实验仪器与材料
1.1 实验仪器
SWTJ水平流净化工作台(苏州市净化设备总厂);Model680型酶联免疫检测仪(美国BioRad Laboratories);HY5回旋式振荡器(江苏省金坛市宏华仪器厂);DK8D型电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司);倒置相差显微镜(德国Leica DMIL);培养箱(Thermo Forma 371);SZ93自动双重纯水蒸馏器(上海雅荣生化设备仪器有限公司)。
1.2 实验材料
宫颈癌HeLa细胞、肺癌A549细胞(本院药理教研室保存);MTT(Thiazolyl Blue 噻唑兰,Sigma分装,北京鼎国生物技术有限责任公司);RPMI 1640培养液(吉诺生物医药技术有限公司);RPMI Medium 1640无叶酸培养基(CIBCO);特级胎牛血清(天津市濒洋生物制品科技责任有限公司);胰酶(Sigma,北京利科恒达科贸有限公司); 96孔培养板(加拿大 JET Biochemicals Intl.，Inc); 叶酸(企业标准，上海新量化工试剂有限公司);5氟尿嘧啶(5FU，南通精华制药有限公司);5氟尿嘧啶白蛋白(5FUB，实验室自制);叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白(5FUBF，实验室自制),其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 药物在体外的细胞毒性[10,11]
实验分5组:空白对照组(不加细胞)、阴性对照组(加细胞,不加药)、5氟尿嘧啶组(5FU,阳性对照组)、5氟尿嘧啶白蛋白组(5FUB,不接叶酸)、叶酸偶联的5氟尿嘧啶白蛋白组(5FUBF,接有叶酸),用含10%(φ)胎牛血清RPMI 1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态良好的细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用PBS洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸RPMI1640培养液配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/mL以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔100 μL。将培养板移入培养箱中,在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下分别培养24 h后更换100 μL无叶酸RPMI 1640培养液,并分别加入5FU,5FUB,5FUBF药液各100 μL,使终质量浓度分别为2 μg/mL,10 μg/mL,50 μg/mL的 (偶联物均折算成5Fu的等价浓度),再培养36 h后,每孔更换为100 μL无血清无叶酸RPMI1640培养基的培养基,加入20 μL MTT溶液( 5 mg/mL ) ,在微量振荡器上振荡3 min,继续培养4 h,弃培养液,孔加入150 μL DMSO,酶联免疫检测仪测定490 nm吸光度(A) 。每种药物浓度设6个复孔。根据抑制率=(1-A药物/A对照)×100%计算抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图1。从图1A中可看出,叶酸偶联物5FUBF的对宫颈癌FR(+)HeLa细胞的毒性最强,其次是5FU,5FUB的细胞毒性最弱。而在图1B中原料药5FU对FR(-)A549细胞的毒性最强,叶酸偶联物5FUBF与无偶联叶酸的5FUBF对FR(-)A549细胞的毒性都很低。
2.2 药物在体外的细胞靶向性验证[12]
实验分6组: 空白对照组(不加细胞)、未加叶酸的阴性对照组(加细胞,不加药,也不加叶酸)、加有叶酸的阴性对照组(加细胞,不加药,但加有叶酸)、5FU、5FUB、5FUBF,给药质量浓度均为10 μg/mL (偶联物均折算成5Fu的等价浓度),分别用质量浓度为0.1、1、10 μg/mL 叶酸进行阻断。用含10%(φ)胎牛血清RPMI 1640培养液培养细胞,取处于对数生长期、生长状态细胞,用0.25%胰蛋白酶消化单层培养细胞,离心使细胞沉淀,用PBS洗涤,用含10%(φ)胎牛血清无叶酸RPMI 1640培养基配成单个细胞悬液,细胞密度为105个/mL,以每孔104个细胞接种于96孔培养板中,每孔100 μL。将培养板移入培养箱中,在37 ℃、φ=5%CO2及饱和湿度条件下分别培养24 h后更换100 μL培养液,并分别先在各组中加入50 μL游离叶酸(叶酸质量浓度分别为0. 4、4、40 μg/mL,以使得叶酸终质量浓度为0.1、1、10 μg/mL)阻断叶酸受体,再分别加入50 μL,5FU,5FUB,5FUBF药液使各药物终质量浓度为10 μg/mL(偶联物折算成5Fu的等价浓度) ,培养36 h后 ,同“2.1” MTT法测抑制率,并以抑制率对药物浓度作图,结果见图2,从图2A中可以看出,叶酸偶联物FUBF对叶酸阳性受体FR(+)HeLa细胞的细胞毒性因游离叶酸的浓度不断增大而显著减弱,而游离叶酸对5FU,5FUB基本不影响;从图2B中可看出叶酸受体阴性FR(-)A549细胞中游离叶酸的加入对5FU,5FUB,5FUBF的细胞毒性均无影响。