缺氧海马神经元中KATP对基因Bax表达的影响
【摘要】 目的 研究缺氧海马神经元中KATP对基因Bax表达的影响。方法 对原代海马神经元进行缺氧和药物处理，倒置显微镜和NF免疫组织化学法观察细胞生长和形态，MTT法检测细胞凋亡率，RTPCR检测Bax基因mRNA表达水平。结果 与单纯缺氧组比较，缺氧+二氮嗪组和缺氧+甲苯磺丁脲组的多级神经元百分率和细胞存活率差异有显著性(P<0.01)。缺氧+二氮嗪组中基因Bax的mRNA表达水平与单纯缺氧组相比下降(P<0.01)，缺氧+甲苯磺丁脲组中基因Bax的mRNA表达水平相对于单纯缺氧组也有提高(P<0.05)。结论 缺氧时KATP的开放对细胞具有保护作用，它通过降低Bax的表达抑制缺氧海马神经元的凋亡。
【关键词】 KATP;Bax基因;缺氧; 海马神经元
Abstract:Objective To study the effect of KATP on gene Bax in hippocampal neurons under hypoxia condition.Method The neurons were exposed to hypoxia condition or treated with medicine. Inverted microscope and immunohistochemistry of NF were performed to assess the growth and morphology of the cells. Cell viability was measured with MTT cell assay. RTPCR was used to detect expression of Bax mRNA levels.Results Compared with hypoxia groups,the percentage of multipolar neuron and survival rate of primary cultured hippocampal neurons in diazoxide and tolbutamide with hypoxia groups showed statistical difference ( P<0.01). The experiments showed a significant increase in Bax mRNA levels (P<0.01) in neurons cultured at severe hypoxia condition compared with those cultured at normoxia. In hypoxia groups,tolbutamide increased Bax mRNA expression (P<0.05),while diazoxide reduced it (n=5 for each).Conclusion The activation of KATP channels could partially reduce cell death during hypoxia. And it also indicated that KATP protects hippocampal neurons from hypoxia by suppressing Bax expression.
Key words:KATP; Bax; hypoxia; hippocampal neuron
ATP敏感性钾通道广泛分布于中枢神经系统和其他外周组织中，调控多种生理活动。缺氧作为一种重要的生理应激反应，自然也受到KATP的调控，但其具体的机制还不是很清楚。Bax是一种重要的细胞调节因子，其产物可以使线粒体释放细胞色素C，从而诱导细胞进入凋亡途径。本实验选取了KATP特异性激动剂二氮嗪和抑制剂甲苯磺丁脲[1]来处理常氧和缺氧时的神经元，观察KATP通道的开关对于基因Bax表达的影响，从而初步探讨KATP对神经元保护的具体机制。
1 材料与方法
1.1 材料
实验动物 出生后1 d的SD大鼠，雌雄不限，由南方医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK粤20060015。
主要试剂 DMEM高糖培养液干粉(GIBICO);多聚赖氨酸10 mg/L(Sigma公司,USA);血清(杭州四季青公司);甲苯磺丁脲(Sigma公司，USA);二氮嗪(Sigma公司，USA);二步法免疫组化检测试剂盒(DAKO);Trizol(Invitrogen，USA);一步法RNA PCR试剂盒(Takara，Japan)。
1.2 细胞培养
取出生后1 d的SD乳鼠，用体积分数75%的乙醇消毒，断头置于DHanks平衡盐溶液中。无菌条件下解剖出大鼠的大脑组织并置于另一含有Dhanks的器皿内。轻轻剔除脑膜及血管组织，进一步分离出双侧海马组织。移至含有Dhanks的小青瓶内，剪成约1 mm×1 mm×1 mm 小块(以上步骤均在冰上操作) 。加入5倍体积的1. 25 g/ L 胰酶(四季清)(37 ℃) ，消化10 min ，中间轻轻振摇2～3次，用含体积分数20%FBS的DMEM终止消化，400目筛网过滤，除去未消化完全的组织块。将过滤得到的细胞悬液移入离心管中，1 000 r/min离心5 min。此时大部分的神经细胞已经沉淀到离心管底部，去除上层培养液，加入新培养液，用吸管轻轻吹打，重新悬浮细胞。将细胞浓度调至1×106个/mL左右，接种于包被有多聚赖氨酸(10 mg/mL，Sigma)的培养板中，置于φ=5%的CO2培养箱中培养(37 ℃)，48 h后使用阿糖胞甘(AraC)处理细胞48 h，以去除其中的增殖细胞，以后每3天换液1次，每次换半量。使用的是含有体积分数10%胎牛血清(四季清)、青霉素1 U/L单位和链霉素100 mg/L单位(Gibco)的DMEMF12培养基(四季清)进行培养。
1.3 缺氧处理和分组
实验分为6组。①常氧组：细胞于37 ℃孵育,并持续通以950 mL/L O250 mL/L CO2 混合气。②常氧+二氮嗪组：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/L二氮嗪的培养基，细胞于37 ℃孵育，并持续通以950 mL/L O250 mL/L CO2 混合气。③常氧+甲苯磺丁脲组，细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/L甲苯磺丁脲的培养基，细胞于37 ℃孵育，并持续通以950 mL/L O250 mL/L CO2 混合气。④缺氧组：细胞于37 ℃孵育，并通入950 mL/L N250 mL/L CO2混合气24 h模拟缺氧。⑤缺氧加二氮嗪组：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/L的二氮嗪的培养基，37 ℃孵育，通入950 mL/L N250 mL/L CO2 混合气24 h模拟缺氧。⑥缺氧+甲苯磺丁脲：细胞培养7 d左右时换为含有100 μmol/L甲苯磺丁脲的培养基，37 ℃孵育，通入950 mL/L N250 mL/L CO2 混合气24 h模拟缺氧。二氮嗪和甲苯磺丁脲都在缺氧前2 h加入培养基中。
1.4 细胞活力检测
采用MTT比色法检测细胞活力，向96孔板内加入MTT(Sigma)液，孵育4 h，弃上清，每孔加150 μL DMSO(二甲基亚砜)，振荡15 min左右，使紫色结晶物充分溶解，用酶联免疫检测仪(BioRad 680)测定A值(570 nm)。每个96孔板均设空白对照,每组各孔A值均为减去空白对照后数值。按以下公式计算各组细胞存活率：细胞存活率(%)=各缺氧和药物处理组A值/常氧组A值。
1.5 NF免疫组织化学检测与分析
细胞接种7 d，取出24孔板内的盖玻片，用PBS洗5 min×3，随后用中性甲醛室温下固定20 min，PBS洗净固定液。按以下步骤进行免疫组化染色：(1)室温3%H2O2孵育5～10 min，以灭活内源性过氧化物酶，PBS洗5 min×3;(2)加一抗(DAKO)，室温孵育30 min，PBS洗5 min×3;(3)加二步法免疫组化检测试剂盒(DAKO)中的A液50～100 μL，室温孵育1 h左右，用PBS洗5 min×3;(4)滴加显色剂DAB工作液50～100 μL，室温孵育5～10 min;(5)脱水，透明，封固。
1.6 神经细胞形态学观察
在400倍倒置相差显微镜(Olympus 1×70)下观察培养神经元的生长状况，每组随机选取6个区域，计算各组细胞中多级神经元(含有3个突起以上)的百分比。
1.7 RTPCR检测
使用Trizol(Invitrogen，USA)提取细胞的总RNA，并测定浓度(Beckman DU530)。采用一步法试剂盒(Takara，日本)进行RTPCR(PE2400)反应。引物均由上海英骏生物技术有限公司合成。Bax的序列： 上游引物5′GAGTGTCTCCGGCGA ATTG 3′，下游引物5′TGGTGAGCGAGGCGGTGAG 3′,扩增产物大小379 bp;内参对照GAPDH的序列：上游引物5′GGCATCCTGGGCTACACTG 3′，下游引物5′TTTGGGTGCAGCGAACTTTA 3′，扩增产物大小403 bp。引物的使用浓度均为50 pmol/μL。反应条件：Bax最适退火温度是58 ℃。PCR 产物于20 mL/L的琼脂糖凝胶做电泳，凝胶成像系统对电泳条带拍照并进行半定量分析。Bax mRNA相对表达量以同一反应体系中目的产物电泳条带密度指数与内参GAPDH电泳条带密度指数的比值来表示。