五鹤续断18S rRNA基因序列的分析

                    作者：罗洪斌，张健，胡泽华 ，丁莉

【摘要】  目的研究中药五鹤续断叶18S rRNA基因的序列特征，为五鹤续断分子鉴定提供分子依据。方法采用PCR直接测序技术测定五鹤续断的18S rRNA基因核苷酸序列，并分析其序列组成。结果通过对五鹤续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai 叶的18S rRNA基因序列进行测序，获得了五鹤续断18S rRNA基因序列特征。结论DNA测序技术可作为五鹤续断基原鉴定准确而有效的分子鉴定方法，也可为五鹤续断分子鉴定提供基础性资料。

【关键词】  分子鉴定; 五鹤续断; 18S rRNA基因; 序列分析

　五鹤续断Dipsacus asperoides C.Y.cheng et T.M.Ai为产于湖北省恩施自治州鹤峰县和宜昌市五峰县中药，属川续断科植物，多年生草本，药用部位为其干燥根[1]，常生长在海拔1 200～2 500 m的高寒地区，具有耐严寒、喜湿润等特征，无病虫害等特点，是上等的中药原料。五鹤续断经过加工后具有根条粗，无头尾，质柔软，墨绿色(俗称乌梅色)菊花心，气味微苦，微甜而涩的品质特色。尤其是“乌梅花心”的特征享誉国内外[2]，为恩施州道地药材。其有效成分主要有皂苷、挥发油类、生物碱类和维生素E等，它具有补肝益肾，续接筋骨，止血安胎等功效，临床上主要用于治疗跌打损伤、骨折[3]、腰椎骨质增生、先兆性和习惯性流产[4]等症。

　　传统上五鹤续断鉴定方法主要是通过其形态和活性成分来进行鉴定，在分子水平上仅见张文蘅等[5]对川续断目(广义)下双参属的两个种在内的21种植物和外类群用叶绿体DNA trnL-F序列进行分析，探讨双参属的系统位置，在国内外尚未见用18S rRNA基因测序方法对五鹤续断基源进行分类鉴定的研究报道。同时，从分子生物学水平研究中药植物基源的基因，寻找有效成分的功能基因，对中药现代化研究也具有重要意义。目前，已广泛运用18S rRNA基因测序技术进行人参、三七、山药、姜黄、大黄等药材的基源鉴定[6～11]。本研究是通过PCR直接测序的方法对产于湖北省鹤峰县的五鹤续断核基因组18S rRNA基因序列特点进行分析，为探讨五鹤续断的系统发育关系和分子鉴定提供分子依据和基础性资料。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料五鹤续断叶片均采自湖北省恩施土家族苗族自治州鹤峰县走马镇万寺坪道地药材五鹤续断GAP研究及种植基地，经湖北民族学院医学院中药教研室袁成玉副教授鉴定，用干燥剂将叶片干燥后置于-80℃冰箱备用。

　　1.2 试剂Taq DNA聚合酶、dNTPs等，购自大连宝生物有限公司;十六烷基三甲基溴化锭(CTAB)为Geneview分装，购自北京鼎国生物技术有限责任公司;引物由大连宝生物有限公司合成。

　　1.3 仪器梯度PCR仪购自德国Eppendorf公司：电泳仪购自北京六一仪器厂;BeckmanD/U530紫外分光光度计购自美国Beckman公司。

　　2 方法

　　2.1 DNA的提取采用改良的CTAB法抽提五鹤续断基因组DNA，样品吸光值D(260)/D(280)在1.8～2.0之间，经纯化后将DNA浓度调整为50 μg/L应用。

　　2.2 PCR扩增18S rRNA基因PCR扩增的通用引物根据Sogin设计的序列合成，分别为18SF(5′-CAA CCT GGT TGA TCC TGC CAG T-3′)和18SR(5′-CTG ATC CTT CTG CAG GTT CAC CTA C-3′)[12]。PCR反应体系为50 μl，其中50～100 ng模板DNA，10×PCR Buffer(含Mg2+)5 μl，2.5 μmol/L dNTPs，0.25 μmol/L引物，Taq DNApol 1.5U，灭菌双蒸水补足体积为50 μl。优化条件，其18S rRNA最佳的扩增程序为98℃10 s，1个循环，65℃8 min，30个循环;72℃ 8 min，1个循环。

　　将PCR产物取8 μl用1%琼脂糖凝胶电泳分离，溴化乙锭(EB)染色，紫外灯下照射观察，其余的PCR产物送上海英骏生物技术公司(Invitrogen)测序。

　　2.3 序列分析PCR产物序列由上海英骏生物技术公司测序。得到基因序列后，在GeneBank上进行Blast，证实属于续断属植物18S rRNA基因序列，并已提交GeneBank，注册登记号为GQ906563。

　　3 结果

　　在本研究中，为避免五鹤续断含有的多糖对实验结果的影响，采用改良的CTAB法提取得到样品的总基因组DNA，吸光值D(260)/D(280)在1.8～2.0之间，电泳图(见图1)可明显看出DNA条带清晰整齐，无明显的拖尾现象，表明该DNA样品质量较好，符合实验要求。利用18S rRNA基因通用引物进行PCR扩增反应，获得预期约1.8kb的双链产物(见图2)。经过测序结果发现，五鹤续断18S rRNA基因核苷酸序列长度为1753bp，其G+C含量为49.97%。根据Genebank上blast比对与亲缘关系最近的川续断科Dipsacus sp. Jansen 931(注册登记号为U43150)的同源性为99%，仅三个位点变异，第6个位点缺失，第1075(G-K)和1290(G-N)位点发生置换。1-D. asperoides 1-D. asperoidesDNA M-λ-Hind III M-200bp DNA Ladder plus　图1 样品DNA电泳图 图2 18S rRNA基因的PCR产物电泳图