超声提取飞廉悬浮细胞总黄酮的工艺研究

【摘要】  目的研究超声提取飞廉悬浮细胞中总黄酮的最佳工艺。方法以总黄酮含量为指标,利用正交实验设计考察提取工艺的最佳组合。结果最佳工艺为以60%乙醇为提取剂,料液比1∶20 ( g /ml)，提取温度为60℃，提取时间30 min。结论最佳提取条件下，飞廉细胞中的总黄酮含量为8.73 mg /g。

【关键词】  超声提取;飞廉悬浮细胞;总黄酮;正交实验

　飞廉Carduus crispus L，是飞廉属植物，为二年生或多年生草本[1]，遍布全国各地，资源非常丰富。到目前为止已从飞廉属不同植物中分离得到黄酮、木脂素、香豆素、生物碱、三菇、单菇、苯丙素，以及幽醇等活性成分[2]，主要用于治疗风热感冒，头风晕眩，风热痹痛，皮肤瘙痒，尿路感染，乳糜尿，尿血带下，跌打瘀肿，疗疮肿毒，烫火伤等[3]。悬浮培养药用植物细胞可以代替药用植株做为活性成分的提取材料，具有生长周期短，活性成分含量稳定，可以人为控制，并且可以大规模培养的优点[4]。虽然飞廉属植物具有很好的药用价值，但到目前为止，与之相关的研究报道还很少见到，现有的几篇文献也集中在分析该属植物的主要化学成分上[1～3]。前期实验发现，黄酮类物质为飞廉的主要活性成分之一，具有很好的生物活性。为了更好地开发利用它的药用价值，我们以总黄酮含量为考察指标,对飞廉悬浮细胞中总黄酮提取工艺进行了优化。

　　1材料与仪器

　　1.1原料飞廉植株由杭州市药物种植场提供，飞廉愈伤组织由浙江工商大学食品和生物工程学院细胞工程实验室诱导选育。将愈伤细胞转接到MS液体培养基上(MS+1×10-5 mol/L，NAA+2×10-6 mol/L，BA+30g/L 蔗糖，pH5.8，121℃灭菌20 min)，于25℃，110 r/min下黑暗振荡培养,接种量为60 g /L，建立飞廉悬浮细胞系。实验所用的飞廉悬浮细胞已经过多次继代培养，具有比较稳定的形态特征和生长速率。

　　1.2试剂与仪器芦丁对照品 ( Sigma)，UV-2100型紫外可见分光光度仪(尤尼柯仪器有限公司)，SHBⅢ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司)，电热鼓风干燥箱101A-2型(上海市实验仪器总厂)，AB204-N电子分析天平(梅特勒.托利多仪器有限公司), THZ-D台式恒温振荡器(太仓市实验设备厂)，SW-CJ-1F型净化工作台(苏州净化设备厂)，KQ3200DE型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

　　2方法与结果

　　2.1分析方法

　　2.1.1正交实验设计根据预实验结果，选择乙醇浓度、料液比、提取温度、提取时间为实验因素，采用L9(34 )正交表进行实验,设计的因素水平见表1，以飞廉细胞中总黄酮的含量作为评价指标。

　　2.1.2对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品5 mg，溶于50 ml 60%的乙醇中，配成0.1 mg/mL母液。取0.0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 ml母液于10 ml容量瓶中，补加60%的乙醇溶液至5 ml，混匀。加5%的亚硝酸钠0.4 ml，混匀，放置6 min，再加10%的硝酸铝0.4 ml，混匀，放置6 min。加4%的氢氧化钠4 ml， 最后加60%的乙醇至刻度线，放置15 min后，510 nm处测其吸光度值。测得其标准曲线为Y=0.066 5X+0.000 7 (R=0.999 8)，其中X为吸光度值，Y为单位体积黄酮含量。表1因素水平