二仙汤治疗男性更年期综合征临床疗效与细胞色素P450 3A4基因多态性关系的研究

                作者：杨明 丁春燕 陈经宝 黄羽 朱首伦 曾星

【摘要】  目的探讨二仙汤治疗男性更年期综合征临床疗效的个体差异与细胞色素P450 3A4(CYP3A4)酶基因单核苷酸多态性的相关性。方法76例肾阴阳两虚证男性更年期综合征患者使用二仙汤治疗3个月，采用伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系症状量化评分法，并参考《中药新药临床研究指导原则》，对肾阴阳两虚证量化评分，用聚合酶链反应(PCR)扩增CYP3A4rs2242480基因，分析二仙汤的临床疗效与CYP3A4rs2242480酶基因单核苷酸多态性的关系。结果治疗组与正常对照组之间基因型及等位基因分布无显著性差异，有效组49例受试者中有30例的CYP3A4rs2242480基因型为C/T (61.22%)，无效组27例受试者中有17例的CYP3A4rs2242480基因型为C/C(62.96%)。基因组间治疗前、治疗后的症状、体征评分无明显差异;基因组间肾阴阳两虚证主证、次症评分也无明显差异。结论二仙汤治疗男性更年期综合征个体含CYP3A4rs2242480基因型为C/T有效率较高，个体含CYP3A4rs2242480基因型为C/C无效率较高。

【关键词】  二仙汤; 男性更年期综合征; 细胞色素P450 3A4

　男性更年期综合征是男性从中年步入老年时期出现相应临床症状和体征的一组证候群，近年来研究证明，男性从中年以后雄性激素水平逐渐下降，引起上述症状[1]，临床上用睾酮作为补充治疗，但长期使用睾酮对身体多个系统和器官产生影响[2]，因此，使用中药二仙汤治疗是一个较好的选择。

　　二仙汤是已故名医张伯讷教授在20世纪50年代所创的组方，它是一剂被用来治疗更年期综合征的经验方。经过几十年的临床观察，目前它已被广泛应用于临床。但在临床上应用二仙汤治疗男性更年期综合征对一些肾虚病人有效，但对另一些肾虚病人效果较差或无效，这是我们经常遇到的问题。即使中药的所用药物时间和药物量相同，也会出现不同的治疗效果，出现不同的疗效多归因于中药的品种，药物的炮制，煎煮火候等原因，很少从病人个体差异方面进行研究，由于对中药药物代谢动力学、生物利用度等方面研究工作甚少，缺乏为药物的临床应用提供可靠的资料，对中药的应用仍按照医生的临床经验以及习惯用法。

　　我们选用二仙汤在治疗肾虚证男性更年期综合征出现的治疗差异，结合研究病人个体差异与细胞色素P450 3A4酶基因单核苷酸多态性的相关性，初步探讨中药治疗中出现的不同的疗效个体对药物敏感性与药物代谢酶基因多态性的关系。

　　1 资料与方法

　　1.1 病例选择治疗组患者均来自本院男科门诊，共76例肾阴阳两虚证，年龄35～63岁，平均51岁;对照组为本院自愿者，共68例，年龄 32～50岁，平均42岁。

　　1.2 入选标准

　　1.2.1 西医诊断标准为了对患者症状诊断性筛查具有客观性，采用伊斯坦布尔Bosphorus大学心理系将症状量化的方法，对男性更年期综合征症状评分，体能症状 + 血管舒缩症状≥ 5 分，精神心理症状≥ 4 分，性功能症状≥ 8 分者可诊断为男性更年期综合征。

　　1.2.2 男性更年期综合征肾阴阳两虚证中医诊断根据国家《中药新药临床研究指导原则》，参考“肾阳虚证及肾阴虚证的临床研究指导原则”明确中医诊断[3]。主症：腰膝酸痛，畏寒肢冷，性欲减退，舌质淡暗，苔白干，脉沉细无力。次症：精神不振，头目眩晕，耳鸣，梦多易醒，脱发，夜尿频多，大便时秘时泄。按症状轻重分级，分为 4 级。

　　1.2.3 排除标准①有急、慢性肝肾功能损害者和心功能损害者; ②有睡眠呼吸暂停综合症者; ③有红细胞增多症者; ④前列腺癌、良性前列腺增生伴有排尿障碍者; ⑤有严重心血管疾病及脑卒中病史者。

　　1.3 治疗方法使用二仙汤治疗：仙茅 15 g，仙灵脾 15 g，巴戟天 10 g，当归10 g，知母 10 g，黄柏 10 g。1剂/d，水煎至150～200 ml，分 2 次服，12周为1个疗程。

　　1.4 安全指标观察每例对象治疗前后7:30～8:30前臂采血，做谷丙转氨酶(ALT)、肌酐(Creat)、游离睾酮(F-T)。

　　1.5 疗效观察

　　①总分值=中医肾阴阳两虚证相关症状及体征分值+男性更年期综合征相关症状及体征分值

　　②疗效指数=(治疗前症状评分总分值-治疗后症状评分总分值) / 治疗前症状评分总分值

　　1.6 疗效判定标准

　　1.6.1 有效男性更年期综合征症状、体征好转; 疗效指数≥30%。

　　1.6.2 无效男性更年期综合征症状、体征无改善;疗效指数<30%。

　　1.7 实验研究

　　1.7.1 试剂OIAamp DNA Blood MiniKits、内切酶RsaI，英韦创津生物有限公司。EDTABuffer50×1L Bio-Rad Laboratories，晶美生物工程有限公司。Taq Platinum PCR MasterMix 、DNALadders(50 bp)，天根生化工程有限公司。

　　1.7.2 DNA提取取静脉血2 ml，经溶膜液/蛋白酶K消化，常规提取基因组DNA。

　　1.7.3 PCR扩增①引物如下：1F：(5'-CAGAGCCAGCACGTTTTACA-3')1R：(5'―CGTGGCCCAATCAATTATCT―3')。②在各个反应管中分别加入Taq Platinum PCR MasterMix 25 μl，双蒸水21 μl;引物(10 pmol/L)各1 μl，DNA模板2 μl。③扩增反应在PCR热循环仪(美国Bio-Rad公司)上完成， 扩增参数为：95 ℃预变性3min;95℃ 30 s ，50℃ 30 s，72℃ 60 s ，共40个循环;72℃延伸7 min 。P C R产物片段长度为354 bp。

　　1.7.4 扩增产物酶切扩增产物以限制性内切酶RsaI消化，酶切反应体系总体积 17 μl，包括PCR产物10 μl ，RsaI酶7 μl(1 u/μl)。酶切反应条件为37℃水浴过夜，在65℃下10 min终止酶切反应。

　　1.7.5 基因型的判断RsaI酶切片段行2%琼脂糖电泳，判断基因型。一次性凝胶系统下拍照，根据条带判断其基因型：若出现了197，157 bp两个条带，则其为基因型T/T;若出现了354，197，157 bp三个条带，则其为基因型C/T;若仅出现了354 bp一条条带，则为基因型C/C。见图1～2。

　　1.8 统计学方法采用SPSS13.0统计软件包建立数据库，基因分值组间比较采用方差分析，方差不齐者采用秩和检验(Wruskal-Wal1isH)，计数资料组间构成比比较采用检χ2验，检验水平α=0.05。

　　2 结果

　　2.1 治疗前后总分值变化经二仙汤治疗后，76例男性更年期综合征患者治疗前后总分值见表1，其中疗效指数>30%占49例，二仙汤治疗男性更年期综合征的有效率为64.47%，疗效指数<30%的占27例，二仙汤治疗男性更年期综合征的无效率为35.52%。见图3。