兜唇石斛多糖提取及脱蛋白工艺研究

                   作者：赵俊凌，马洁，李戈，段立胜   

【摘要】  目的研究兜唇石斛多糖提取及脱蛋白的制备工艺。方法采用正交实验设计制备不同提取条件多糖溶液，苯酚-硫酸法测定溶液中多糖含量，光密度差值法测定蛋白含量。结果兜唇石斛多糖提取的最佳条件，提取温度100℃，提取时间2 h，加水量200 ml，醇析浓度为80%，醇析时间30 h，多糖脱蛋白的最佳条件，样品/萃取剂(V/V)为4∶1，氯仿/正丁醇(V/V)为4∶1，萃取时间30 min。结论不同提取及萃取条件下，兜唇石斛多糖提取及脱蛋白测定结果存在明显差异。

【关键词】  兜唇石斛; 多糖; 提取; 脱蛋白; 正交设计

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the optimum conditions of extraction and deproteinization from polysaccharide of Dendrobium devonianum.

　　MethodsThe different concentrations of polysaccharide extraction were acquired with the orthogonal experimental design,and the phenolsulfuric acid method and UV spectrophotometric method were used to determine the content and deproteinization of polysaccharide.

　　ResultsThe optimum conditions of polysaccharide extraction from Dendrobium were established as follows:extracting temperature of 100℃,extracting time 2 hours,volume of adding water 200ml,precipitation concentration of ethanol 80%,precipitation time of ethanol 30 hours,that of deproteinization were established as follows:Chloroform-n-butanol 4:1,Chloroform:n-butanol 4:1,stirring time 30 minutes.

　　ConclusionUnder the different condition of extraction and deproteinization,there has significant differences on the determination results for the content of polysaccharide and protein in Dendrobium devonianum.

　　Key words：Dendrobium devonianum; Polysaccharide; Extraction; Deproteinization; Orthogonal design

　　石斛属Dendrobium是兰科中的第二大属，全球共有约一千五百多种，主要分布于亚洲的热带和太平洋岛屿的东亚、东南亚及澳大利亚等地区，我国有76种(74个种，2个变种) 主要分布于华南及西南地区。石斛作为一种名贵中药被《本草纲目》收录，在《神农本草经》中也被列为上品，其有养胃生津、滋阴清热、明目的功能,用于阴伤津亏，口干烦渴，食少干呕,病后虚热,目暗不明等症状。现代药理研究发现石斛属植物具有抗肿瘤、免疫调节、抗氧化、抗血小板聚集、扩张血管、降低血糖等多种活性[1]，同时在治疗胃肠道疾病和治疗白内障方面也有很好疗效。

　　兜唇石斛Dendrobium aphyllum(Rohb. ) C. E. Fishcher为市场上流通品种，其药理和化学成分的研究都相对较少，赵永灵[2]等从兜唇石斛的茎中分离得到3种多糖: AP-1,AP-2,AP-3。它们的分子量分别为86 300，61 500，43 100。它们是β-(1→4)连接的,含O-乙酰基的,吡喃型的直链D-葡萄甘露聚糖，能使ICR纯系小鼠脾重量、胸腺重量增加，抗体细胞数明显增多，T细胞和B细胞显著增殖，具有免疫增强作用。张朝凤等[3]从兜唇石斛分离了11个芳香族类成分,其中9个为茋类化合物是首次从该植物中分离得到，4, 4′-二羟基-3, 3′、 5-二甲氧基联苄(1)、 3′, 4-二羟基-3, 5′-二甲氧基联苄、 3, 3′-二羟基-5-甲氧基联苄(3), 3, 4, 5-三羟基-3-甲氧基联苄, 3, 5, 4′-三羟基联苄, 3, 5-二甲氧基-4, 4′-二羟基-联苄, 2, 5-二羟基-4-甲氧基菲, 2, 4, 7-三羟基-9, 10-二氢菲和2, 5-二羟基-4-甲氧基-9, 10-二氢菲(hircino,l9);另外两个苯乙烷类衍生物，对羟基苯乙醇葡萄糖苷和对羟基苯乙酸为首次从石斛属分离得到。邵莉等[4]从兜唇石斛分离并鉴定了8个化合物，其中4′-甲氧基苜蓿素，苜蓿素, 7 , 3′ , 5'-tri-O-methyltricetin，阿洛醇，蔗糖和icariside DZ为首次从该属植物中分离得到;酚类化合物丁香酸、木脂素类化合物丁香脂素为首次从该植物中分离得到。黎英等[5]发现兜唇石斛的水提物对·OH均有很强的清除作用。本实验对兜唇石斛多糖的提取及脱蛋白纯化工艺进行研究，为兜唇石斛开发利用提供参考。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料兜唇石斛产地为云南省，由药用植物研究所云南分所王云强助理研究员鉴定。

　　1.2 试剂与仪器苯酚、浓硫酸、石油醚、无水乙醇、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醚等均为分析纯。旋转蒸发器R-210(瑞士布奇)，TU-1901新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)， 数显恒温水浴锅HH-4(常州国华电器有限公司)，GZX-9140恒温数显鼓风干燥箱(上海博讯设备有限公司)，METTLER TOLEDO系列分析天平AB135-S，PL203。

　　2 方法与结果

　　2.1 标准溶液配制[6～9]精密称取 105℃干燥恒重的标准葡萄糖 100.0 mg，置100 ml容量瓶中，加蒸馏水适量使溶解，稀释至刻度，摇匀。精密吸取 10 ml置100 ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，每毫升含葡萄糖0.1 mg。

　　2.2 检测波长的选择精密吸取标准葡萄糖溶液0.3 ml，置于具塞比色管中，加蒸馏水至 2.0 ml，再加苯酚试液 1.0 ml，摇匀，迅速滴加浓硫酸 5.0 ml，盖好塞子，迅速摇匀，放置 5 min，置沸水浴中加热 15 min，取出，冷水迅速冷却至室温，作为供试溶液。另以 2.0 ml蒸馏水同样操作，作为空白对照，在400～600 nm范围对供试溶液进行扫描。葡萄糖溶液在490 nm波长处有最大吸收度,兜唇石斛多糖溶液在490.50 nm波长处有最大吸收度,故选490.50nm作为样品的测量波长。

　　2.3 标准曲线制作精取葡萄糖对照液，0.1，0.2 ，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7 ml，分别加入具塞比色管中，加蒸馏水使成2.0 ml，各加苯酚试剂1.0 ml，在旋转混匀器上摇匀，迅速滴加浓硫酸5.0 ml，摇匀，放置5 min，置沸水浴中加热15 min，冷水迅速冷却至室温。另以蒸馏水2.0 ml同法操作，作为空白对照，在490 nm处测其吸收度。以吸收度值为Y，葡萄糖浓度为X，得回归方程： Y =0.008 11+0.017 31X，r=0.999 5，说明该工作曲线在5.00～35.00 μg间的线性关系良好。图1 标准曲线

　　2.4 精密度实验精取供试溶液5份，每份0.3 ml，加蒸馏水使成2.0 ml，各加苯酚试剂1.0 ml，按标准曲线操作,测定其吸收度。测定结果，葡萄糖RSD=1.23%，兜唇石斛RSD=0.70%，精密度较好。

　　2.5 重复性实验精取干燥后的样品6份，分别提取，每份供试溶液取0.3 ml，加蒸馏水使成2.0 ml，各加苯酚试剂1.0 ml，按标准曲线操作，测定其吸收度。测定结果，兜唇石斛RSD=1.63%，重现性良好。

　　2.6 显色稳定性试验精取供试溶液0.3 ml 加蒸馏水使成2.0 ml,加苯酚试剂1.0 ml，按标准曲线操作，分别测定 30，60，90，120，150，180，210，240 min的吸收度。测定结果，葡萄糖RSD=0.41%，兜唇石斛RSD=0.64%，240 min内有较好的光稳定性。