青蒿琥酯对肝癌HEPG-2细胞Caspase-3和P53蛋白的影响实验研究
作者：陈永顺，李静，杨斌，陈氏红
【摘要】 目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)对肿瘤细胞增殖的影响和机制。方法MTT法测定青蒿琥酯对HEPG-2细胞增殖的影响， ELISA方法研究Caspase-3的活性，DNA电泳观察细胞DNA的变化，免疫组化研究凋亡相关蛋白p53,bcl-2,bax的表达。结果青蒿琥酯作用细胞48 h后可明显诱导HEPG-2细胞凋亡，并影响Caspase-3,p53,bcl-2蛋白的表达。结论青蒿琥酯可明显抑制HEPG-2细胞的增殖，促进HEPG-2细胞的凋亡，其机制可能是通过激活Caspase-3的活性，以及调节p53，bcl-2蛋白的表达而实现的。
【关键词】 青蒿琥酯; Casepase-3; P53
青蒿琥酯(Art)作为一种含内过氧化基团的倍半萜内酯化合物，主要用于疟疾治疗。近年研究发现，其还具有抗肿瘤作用[1]。本实验以人肝癌HEPG-2细胞株为作用对象，研究青蒿琥酯对肿瘤细胞株相关基因和蛋白的影响。
1 仪器与材料
1.1 仪器全自动CO2孵箱(美国Thermo Formo)，倒置显微镜(日产)，雷勃MK3酶标仪，贝克曼荧光显微镜，凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad)，DMR+Q550病理图象分析系统(莱卡公司)。
1.2 试剂四唑盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司,青蒿琥酯购于桂林南药股份公司(批号060109);紫杉醇，上海华联制药厂生产，购于广西医科大学第一附属医院药剂科(批号060202)， Caspase-3检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)，Annvie-FITC试剂盒(晶美生物公司)，P53-抗，bcl-2-抗,bax-抗(北京中杉生物技术开发有限公司)，细胞凋亡DNA 提取试剂盒(碧云天生物技术研究所)，DNA ladder(广州东盛生物技术开发有限公司)。
1.3 细胞株和细胞培养人肝癌HEPG-2细胞株从广西医科大学实验中心病理科细胞室引进，培养在含10%小牛血清，含青、链霉素各100 u/ml的RPMI-1640培养液中，37℃、5%CO2饱和湿度条件下培养，0.25%胰蛋白酶消化传代。
2 方法
2.1 MTT法检测细胞的增殖活性采用MTT法，取对数生长期的HEPG-2细胞，按每孔细胞3×103～5×103个，190 μl接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，12 h贴壁后加入各组药物，药物终浓度梯度为200，100，50 μg/ml，37℃ 、5%CO2饱和湿度下培养24，48，72 h，OD值测量波长为双波长570 nm/630 nm。以下列公式计算抑制率：抑制率=(1-加药组OD/对照组OD)×100%，实验重复3次。
2.2 Caspase-3 活性的研究经过预处理后的细胞，每2×106个细胞的比例加100 μl裂解液，冰浴15 min，4℃,16 000 g，离心15 min，收集上清，采用Caspase-3 ELISA试剂盒，按说明书操作。由PNA不同浓度对应的OD值得出标准曲线，由样品空中OD值，根据标准曲线方程求得相应样品空中Caspase-3活性浓度。
2.3 DNA LADDER的观察 收集Art处理48 h后的细胞，按照试剂盒说明书，提取细胞DNA，进行1.2%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像分析系统下拍照。
2.4 p53,bcl-2,bax等蛋白的研究免疫细胞化学法检测p53，bcl和bax的表达，按试剂盒说明依次操作，用PBS代替一抗作为阴性对照。
3 结果
3.1 IC50的测定每个浓度梯度的抑制率得出后，采用Bliss法求得Art作用HEPG-2细胞的24，48，72 h的IC50分别为(103.1±8.6)，(75.3±4.1)，(65.7±6.0) μg/ml[2]。
3.2 caspase-3活性的改变测得OD值后，根据OD值由拟合的标准曲线求得相应样品空中活性Caspase-3的浓度(48 h)。与空白组比较，药物作用后细胞中Caspase-3浓度高于对照组(P<0.01)。