消瘤保肺丸对人肺癌PG细胞上皮细胞钙粘蛋白、α-Catenin、及 β-catenin表达水平的影响及意义

              作者：孙宏新 段铮 蒋艳玲 王玲玲 周世繁

【摘要】  目的研究消瘤保肺丸对上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)、α-catenin及β-catenin在人肺癌PG细胞株中表达的影响及其意义。方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶法(SP法)检测人肺癌PG细胞E-cadherin、α-catenin及β-catenin在消瘤保肺丸干预作用下的表达情况。随机分为4组即消瘤保肺丸高剂量组、消瘤保肺丸低剂量组、清肺化痰丸组和空白组。结果E-cadherin与α-catenin、β-catenin在消瘤保肺丸作用下阳性表达率不同，其中E-cadherin在消瘤保肺丸的影响下阳性表达率较低，明显低于清肺化痰丸组和空白(P<0.01);而α-catenin、β-catenin在消瘤保肺丸干预作用下阳性表达率较高，且高于清肺化痰丸组和空白组(P<0.01)。结论消瘤保肺丸对E-cadherin、α-catenin及β-catenin的表达影响显著，提示其对肺癌的侵袭转移有一定抑制作用，从而表明E-cadherin、α-catenin及β-catenin的表达与肺癌的进展和转移密切相关。

【关键词】  消瘤保肺丸; 上皮细胞钙粘蛋白; α-连接素; β-catenin; 人肺癌PG细胞; 免疫组化法

　　肺癌患者的肿瘤转移是导致其死亡的重要原因之一。粘附是肿瘤转移过程中的一个关键环节，粘附因子在其中发挥着不可或缺的作用。上皮细胞钙粘蛋白(E-cadherin)是一类细胞粘附的跨膜糖蛋白，是维持上皮细胞形态及同种细胞间粘附连接的主要粘附分子，E-cadherin借助于α-连接素(α-catenin)连接在E-cadherin与β-catenin之间，大量的实验证实E-cad/catenins复合物介导的细胞同质粘附具有抑制肿瘤侵袭、转移的作用[1,2]。我们针对该环节，研究消瘤保肺丸含药血清对E-cadherin、α-catenin及β-catenin表达水平的影响，以探讨中药抗癌转移的作用机制。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药物消瘤保肺丸，该药由河南省中医院院内制剂室提供，批号：20070514;清肺化痰丸，昆明中药厂有限公司，国药准字Z53020763，批号：080119。

　　1.2 动物及瘤株日本大耳白兔8只，购于河南省动物实验中心;PG 细胞(即人高转移性巨细胞肺癌细胞株)，由北京广安门医院肿瘤实验室提供。

　　1.3 试剂RPMI-1640培养基，美国Gibco公司，编号1313945;优级胎牛血清，天津TBD公司，编号Df-1055;E-cadherin抗体，美国Santa cruz公司，编号MSC8426;α-catenin抗体，美国Zymed公司，编号80900705;β-catenin抗体，美国Santa cruz公司，编号D0708;免疫组化SP-9002试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号51182001;DAB显色试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司，编号375230AJ。

　　1.4 仪器 二氧化碳培养箱HF90型，上海力新HEAL FORCE;电热恒温培养箱HH-B11-600型，国营创新医疗器械厂;生物显微镜XSP-8F型，广西梧州中康贸易有限公司;倒置显微镜CK40，日本Olympus公司;电动离心沉淀机，大连医疗器械厂，LD-6-4。

　　2 方法

　　2.1 动物分组、模型建立与含药血清制备8只健康日本大耳白兔，随机分为消瘤保肺丸高剂量药物组、低剂量药物组，清肺化痰丸对照组、空白组4组(依次简称为消高组、消低组、清肺组、空白组，以下同)，每组2只，每组每天早晚各给药1次，每次10 ml/kg，其中高、低剂量组分别相当于人等效剂量的10、5倍，空白组给以等量生理盐水，连续给药3 d。取兔血制备为含药血清，具体制备过程参照文献[3]。

　　2.2 细胞培养、给药复苏PG冻存细胞，培养基选用含20%优级胎牛血清的RPMI-1640培养基，隔日或每日换液1次，选对数生长期细胞至基本贴满下壁，细胞传代，每培养瓶中加2 ml的0.25%胰蛋白酶液使细胞脱壁，加入8 ml培养基，反复吹打后分入5 ml至新培养瓶。

　　将干净盖玻片放于培养皿，0.1% 多聚赖氨酸液浸泡24 h，PBS缓冲液浸泡2 s后取出放入6孔板，每孔一张玻片。向每瓶加0.25% 胰蛋白酶液使细胞脱壁，分别加入20% 消高组、消低组、对照组及空白组培养基，将细胞浓度调至2×106/L制成细胞悬液，每组加入一6孔板中，每孔加入1 ml细胞悬液，放37℃ CO2培养箱培养48 h。第3天观察细胞贴壁状态，取出盖玻片，经10%多聚甲醛固定20 min后免疫组化用。

　　2.3 免疫组化SP法参照试剂操作说明书:在盖玻片上滴加去离子水(H2O2)1滴，常温放置湿盒中30 min。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。滴加山羊封闭血清1滴，常温放置湿盒中30 min。甩掉血清，滴加目的一抗1滴，放湿盒中置4℃冰箱过液。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。滴加二抗工作液1滴，放湿盒中置37℃电热恒温培养箱孵育15 min。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。滴加链霉卵白液1滴，放湿盒中置37℃电热恒温培养箱孵育15 min。PBS缓冲液浸泡3次，5 min/次。DAB显色剂加1～2滴染色30 s，观察染色情况。清水冲洗10 min。苏木素加1滴染色5 min，清水冲洗10 min。盐酸酒精分化2 s，显微镜下观察，苏木素染色不满意可复染。细胞按50% 乙醇，70% 乙醇，95% 乙醇，无水乙醇的顺序脱水，每个浓度中浸泡5 min(无水乙醇分别浸泡两次)。二甲苯浸泡2次，每次5 min。中性树胶封片于载玻片上。

　　2.4 判断方法 依据阳性细胞所占比例分为3个等级：①阴性(-)，细胞膜无棕色染色或细胞膜染色阳性细胞数<10%;②弱阳性(±)，细胞膜浅棕色，阳性细胞数10%～50%;③阳性(+)，细胞膜棕黄色或棕褐色，阳性细胞数>50%。随机取10个高倍镜下视野，判断每个视野下细胞表达情况并记录。见图1～3。