小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷的含量测定方法研究
作者：胡燕，冯敬文，卢其福，龙晓英
【摘要】 目的建立同时测定小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷含量的高效液相色谱法。方法 采用DiamonsilTM C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)色谱柱，乙腈-0.02%(体积分数)磷酸溶液(体积比23∶77)为流动相，流速为1 mL·min-1，检测波长为228 nm，柱温为30 ℃。结果 连翘苷在0.13~160.20 μg范围内与峰面积呈良好线性关系 (r=0.999 8)，平均回收率为99.43%，RSD=1.02%(n=6)。牛蒡子苷在0.13~322.40 μg范围内与峰面积呈良好线性关系(r=0.999 7)，平均回收率为99.66%，RSD=154%(n=6)。结论 该法专属性强、重现性好，可作为小儿清热利肺口服液中连翘苷和牛蒡子苷的含量测定方法。
【关键词】 高效液相色谱法;小儿清热利肺口服液;连翘苷;牛蒡子苷
Abstract:ObjectiveTo establish a RP-HPLC method for the determination of forsythin and arctiin in Xiaoer Qingre Lifei oral solution.Methods The analysis was performed on DiamonsilTM C18 column with the mobile phase of acetonirile-0.02% phosphoric acid solution (23∶77) under a flow rate of 1 mL·min-1.The detection wavelength was set at 228 nm and column temperature was 30 ℃.Results The calibration curve of forsythin was linear in the range of 0.13-160.20 μg (r=0.999 8).The average recovery of forsythin was 99.43% with RSD=1.02% (n=6).The calibration curve of arctiin was linear in the range of 0.13-322.40 μg (r=0.999 7).The average recovery of arctiin was 99.66% with RSD=1.54% (n=6).Conclusion The method is exclusive and reproducible.It can be applied to determine forsythin and arctiin in Xiaoer Qingre Lifei oral solution.
Key words:HPLC; Xiaoer Qingre Lifei oral solution; forsythin; arctiin
小儿清热利肺口服液由银翘散和麻杏石甘汤两个古方化裁而成,由银花、连翘、牛蒡子、麻黄等11味中药组成[1],主治外感风热邪在肺卫或卫气同病之风热咳嗽,用于发热、咳嗽或咯痰、流涕或鼻塞、咽痛、口渴、舌红或苔黄等证候的小儿急性支气管炎,临床疗效甚佳。连翘、牛蒡子分别为本方的君、佐药,而连翘苷、牛蒡苷分别为两者的特征有效成分。小儿清热利肺口服液的原质量标准采用紫外-可见分光光度法测定其盐酸麻黄碱含量，并未对连翘苷、牛蒡苷进行含量检测。本试验采用HPLC法同时测定小儿清热利肺口服液中连翘苷、牛蒡苷的含量，旨在增加小儿清热利肺口服液的质量控制指标，提高其质量可控性。
1仪器与试剂
LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)，SPD紫外检测器，二元高压梯度泵;BP211D电子分析天平(Satorius);UV-2450可见-紫外分光光度仪(日本岛津); HH-6恒温水浴锅(宏华新佳);连翘苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：11084-200711);牛蒡子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110819-200404);小儿清热利肺口服液(广州潘高寿药业股份有限公司提供，批号：E06002、F03002B、F10001B、I11002B);乙腈、H3PO4为色谱纯，其余试剂均为分析纯。
2方法与结果
2.1色谱条件
色谱柱：DiamonsilTM C18(5 μm，250 mm×4.6 mm);流动相：乙腈-0.02%(体积分数)磷酸溶液(体积比23∶77);流速：1 mL·min-1;检测波长：228 nm;柱温：30 ℃;进样量：20 μL。
2.2对照品溶液的制备
2.2.1对照品贮备液的制备精密称取连翘苷对照品(于室温用P2O5干燥24 h)8.01 mg，置25 mL量瓶中，加50%(体积分数)甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得连翘苷对照品贮备液;精密称取牛蒡子苷对照品(于室温用P2O5干燥24 h)8.06 mg，置25 mL量瓶中，加50%(体积分数)甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得牛蒡子苷对照品贮备液。
2.2.2对照品溶液的制备分别精密吸取连翘苷、牛蒡子苷对照品贮备液适量，同置于25 mL量瓶中，用50%(体积分数)甲醇稀释成连翘苷质量浓度为0.096 mg·mL-1、牛蒡子苷质量浓度为0.097 mg·mL-1的对照品溶液。
2.3供试品溶液的制备
精密吸取小儿清热利肺口服液1 mL至分液漏斗中，用三氯甲烷萃取4次，每次10 mL，合并三氯甲烷萃取液于90 ℃水浴上蒸干，残渣用50%(体积分数)甲醇溶解并转移至50 mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得。
2.4阴性对照溶液的制备
取处方组成中除连翘、牛蒡子之外各药材,按照小儿清热利肺口服液制备工艺制备药液，按“2.3”项下方法制备，即得。
2.5系统适用性试验
分别精密吸取对照品、供试品、阴性对照溶液各20 μL注入液相色谱仪,按“2.1”项下色谱条件测定,记录色谱图。在此条件下,连翘苷、牛蒡子苷和其他组分可达到基线分离,分离度R>5。理论塔板数以连翘苷计，应不低于3 000;以牛蒡子苷计应不低于1 500。阴性对照对连翘苷、牛蒡子苷的测定无干扰，见图1。[PSd281;S*2〗A.连翘苷和牛蒡子苷对照品; B.供试品; C.阴性对照;1.连翘苷; 2.牛蒡子苷图1小儿清热利肺口服液的HPLC图Figure 1HPLC chromatograms of Xiaoer Qingre Lifei oral solution
2.6线性关系考察
精密吸取连翘苷、牛蒡子苷对照品贮备液适量,同置于25 mL量瓶中，用50%(体积分数)甲醇稀释成每1 mL含连翘苷分别为0.13、32.04、64.08、9612、160.20 μg，含牛蒡子苷分别为0.13、64.48、128.96、161.20、322.40 μg的系列对照品溶液。分别吸取上述不同浓度的对照品溶液各20 μL,按“21”项下色谱条件进样,测定峰面积。以峰面积积分值(A)对对照品质量浓度(ρ)绘制标准曲线，求得连翘苷回归方程为A=4.2277×104ρ+1.8754×104，r=0.999 8,线性范围为0.13~160.20 μg·mL-1;牛蒡子苷回归方程为A=3.7802×104ρ-11179×105，r=0.999 7，线性范围为0.13~32240 μg·mL-1。
2.7精密度试验
精密吸取同一对照品溶液(连翘苷质量浓度为0.096 mg·mL-1、牛蒡子苷质量浓度为0.097 mg·mL-1)20 μL注入液相色谱仪，重复进样5次，测定峰面积。结果连翘苷、牛蒡子苷RSD值分别为141%、125%，表明仪器精密度较好。