运动配合中药及艾灸对慢性疲劳综合症大鼠行为及外周血淋巴细胞凋亡的影响
作者：邹军，苑建齐，吕爽，屠嘉衡，季明勇
【摘要】 目的探讨慢性疲劳综合症（GFS）造模对SD大鼠行为及外周血淋巴细胞凋亡的影响，并观察运动配合中药及艾灸作用效果。方法用48只Sprague - Dawley 大鼠，按体质量分4组即对照组(CG)、CFS模型组(CFSG)、运动加中药组(ETCMG)和艾灸组(MG)，每组12只。试验共进行3次旷场与悬尾行为测试，最后进行水迷宫实验和取外周血，流式细胞仪测定淋巴细胞凋亡指数。结果CFSG 、ETCMG、MG参与造模的3组体质量的增长受到严重抑制；旷场行为CFSG行为指数明显降低，ETCMG和MG旷场行为指数比CFSG显著升高；悬尾行为CFSG显著降低，ETCMG比CFSG显著升高，MG悬尾与CFSG无差异；水迷宫可视平台组间无差异，探索第2象限参与造模3组的时间比CG延长；细胞凋亡指数CFSG比CG显著升高，ETCMG比CFSG显著降低，且与CG无差异，MG与CFSG无差异。结论CFS造模抑制大鼠体重增长，行为表现抑郁，外周血淋巴凋亡细胞增多；运动加中药方法有效缓解大鼠行为症状，降低凋亡细胞指数；艾灸方法可缓解大鼠行为症状，但对细胞凋亡未见影响；两种干预方法对记忆行为未见影响。
【关键词】 疏肝健脾中药； 跑笼运动； 艾灸； 足三里； 慢性疲劳综合症； 动物行为； 淋巴细胞凋亡
自从1988年由Holmes等［1］将慢性或反复发作的极度疲劳为特征的症候群命名为慢性疲劳综合症(Chronic Fatigue Syndrome ,CFS)以来,世界很多国家的学者对此进行研究，拟定了相应的诊断标准。
该病的发生与长期精神紧张，脑力、体力长期过度劳累，并与神经、体液调节和免疫功能失调有关。特别是脑力劳动者尤为突出，对社会影响大，还没有安全、有效的药物和方法治疗,护理调养费用较高，给社会卫生福利部门造成较大的压力［2］,因此引起了世界各国的广泛重视，开展了有针对性的研究。近年来，我国也开展有关CFS的基础与临床方面的研究工作，在发病机理，影响因素，症状表现等多有涉及。有关中医药治疗CFS的疗效与机理报道较多，但将运动配合中医药防治CFS的研究较少。
研究有关CFS模型的建立，不同学者方法不尽相同，我们采用慢性束缚、电击、冰水游泳无规律进行刺激的复合方法建立了包含体力和精神的慢性疲劳动物模型［3］。动物身体和精神的疲劳一定程度反映在动物行为和免疫状态上，根据慢性疲劳综合症和祖国医学对“疲劳”的治疗原则,本文拟通过观察动物行为和外周血淋巴细胞凋亡的改变, 从动物行为学和免疫学角度来探讨慢性疲劳综合症发生机制，并观察运动配合疏肝健脾中药和艾灸足三里对其调理作用。
1 材料与仪器
1.1 实验对象由上海西普尔- 必凯实验动物有限公司提供SPF级健康雄性Sprague-Dawley大鼠48只，2月龄，体质量196～247 g，在中国人民解放军第二军医大学基础部神经生物试验室动物房饲养，温度20～22℃，光/暗周期为自然光暗周期，实验前适应饲养1周，自由获得饮水和饲料。
1.2 仪器见表1。表1 实验仪器（略）
1.3 试剂用品药艾条：苏州市东方艾绒厂，批准文号：国药准字Z32020881；中药片剂(由柴胡、白芍、佛手、茯苓、 黄芩、川芎、小麦、大枣、甘草等组成,广州中医药大学提供,批号20060915) ，每片0.5 g，含10.15 g 生药)。淋巴细胞分离液、Binding Buffer试剂、PI碘化丙啶（BEEKMAN COULTER公司）。RPMI 1640 w/o L-Glutamine w/25 mM HEPES；0.3%戊巴比妥250 ml；生理盐水。无钙镁离子磷酸缓冲盐水（PBS）（0.15 mol/L pH 7.2；NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4 1.15 g KH2PO4 0.2 g；将上述试剂依次溶于1 000 ml去离子水中，完全溶解后，115℃高压灭菌10～15 min，存在4℃冰箱中备用。
2 方法
2.1 动物分组称体质量后，将大鼠随机分为对照组(CG)、CFS模型组(CFSG)、运动加中药组(ETCMG)和艾灸组(MG)（组间无差异）。每组12只，标记后分笼饲养，每笼6只。
2.2 CFS造模方法对CFSG、ETCMG、MG三组实施造模。每天电击，用波宽2 ms的电脉冲，1 mA电流强度，时间隔20 s，每天15次电击，共5 min。束缚和冷水游泳隔日交替进行：将大鼠放进自制的行为束缚筒内，束缚2 h/次；冷水游泳，水温12℃，时间5 min，游泳后用电吹风机将大鼠吹干。
2.3 CFS干预方法
2.3.1 ETCMG组干预方法
中药干预：给予疏肝健脾的中药片剂，用温开水溶解，每天灌胃1 ml中药，剂量为按成人每公斤体质量计算剂量的20倍。为排除灌胃对试验的影响，其他各组均灌胃1 ml生理盐水。
运动干预：采用自制跑笼进行，跑笼安装计数器，运动组大鼠在直径40 cm的自制圆形跑笼中进行自主运动，每日跑200圈，总长度约251.2 m，每周7 d。跑动时间约20～90 min不等。试验第1周适应期内，通过训练大鼠，让其能自主跑动。训练的方式为将ETCMG大鼠放进转笼，让其主动跑笼，第1天跑10 min，以后每天增加10 min，直到递增至1 h/d，自动记录跑笼圈数。
2.3.2 MG组的艾灸方法MG组的艾灸方法：与造模束缚同时进行。把艾条分卷成直径6～8 mm的灸条，先将大鼠后肢腿部两侧穴位的毛剃净后放进行为束缚筒，用封箱胶带从大鼠尾部粘贴固定，露出两后肢，持艾条于“足三里”［4］穴上2～3 cm处悬灸,采用温和灸补法，1次/d，两穴15～20 min/次，直至皮肤发红发热为止。
2.4 旷场实验（open-field test）各组大鼠进行3次旷场实验，均采用DigBehv动物行为视频跟踪分析系统（上海吉量软件科技有限公司提供），测试在隔音、避光的开放场箱（60 cm×60 cm×65 cm）中进行。箱左侧面中心装有摄像头。在场箱底面长宽60 cm方形旷场内，中央有16个直径为2 cm的圆形小洞，深1 cm，小洞底为球形凹，安装有红外线计数装置，记录大鼠探洞行为次数。以距离旷场四边15 cm画四条线，即为“井”字，把旷场分为四边、四角，一中央，9个区。视频合成器将大鼠看成一个质点，记录大鼠运动轨迹，记录总路程(cm)、活动时间（s）、中央区路程（cm）、探洞次数。检测固定在19：00～22：00进行。记录时间为3 min，在放入大鼠后1 min开始计时。
2.5 悬尾实验各组大鼠测试3次悬尾试验。采用上海吉量软件科技有限公司JLgBehv动物行为视频跟踪分析系统的悬尾箱，测试在隔音、避光的悬尾箱（60 cm×60 cm×65 cm）中进行。悬挂好后，关闭悬尾箱后即刻开始计时。记录时间为5 min，检测固定在17：00～22：00进行。
活动状态的界定：实验动物质点1 s内位移大于系统设置的设定值（1 mm），则认为试验动物处于活动状态。
2.6 Morris水迷宫实验
2.6.1 Morris水迷宫装置此实验所有大鼠均参与，在实验饲养大鼠的最后5天进行，前4天为学习过程，最后1天为可视平台和探索实验。采用上海吉量软件科技有限公司DigBehv动物行为视频跟踪分析系统的水迷宫装置，由一圆柱形水池和一可移动位置的圆形站台组成。圆柱形水池直径1.8 m，高0.5 m。站台可以25～35 cm高度升降调节，并可以在4个象限，每个象限2个点自由选择站台位置，每个象限的2个点相对于圆心处于同一位置（即相邻象限的站台点成轴对称，相对象限的站台点成中心对称）。站台直径12 cm，位于水下1～2 cm。整个水池、站台用黑色塑料制成，水温24℃。室温26℃。
2.6.2 Morris水迷宫实验方法Morris水迷宫学习实验：本实验目的是让大鼠记忆水池中站台的位置。学习共进行4 d，每只大鼠每天训练4个象限各1次。从造模第22天开始，进行学习实验。在大鼠入水前，将大鼠直接放到水池里的平台上30 s,让大鼠知道水面下平台的方位，将大鼠分别沿着4个象限的池壁的固定位置放入水中，同时启动记录装置开始记录，记录时长为1 min，等大鼠找到平台后让其在平台上再待30 s，目的是给大鼠有记忆方位的时间。第2象限有隐匿平台在，在1 min内大鼠找到并爬上平台后，装置自动停止记录。记录过程电脑自动识别大鼠运动轨迹。若大鼠在1 min内未能找到平台，则直接帮助或指引，或将其直接放到站台上，并让其停留30 s。
Morris水迷宫探索实验：本实验目的是检查大鼠是否记忆站台位置，以及记忆的准确程度。在学习实验4 d结束后进行。拔掉站台，从着第4象限的池壁放入大鼠，其他条件与学习条件相同。统计大鼠穿越原来在第2象限的平台所在位置的次数，以及大鼠在第2象限内的时间和这段时间所占探索时间1 min的百分数。探索试验只做第4象限1个象限。
Morris水迷宫可视平台实验：本实验目的是排除大鼠由于视力原因或游泳体力等非记忆能力因素，而造成组间差异。将站台升出水面2 cm，并用稍微比黑色浅些的毛巾包裹，如果用浅色毛巾包裹站台，视频跟踪系统会误将站台视为大鼠，因为站台不动而迅速终止记录。站台换到第4象限，位置与在第2象限的相同，将大鼠从第2象限沿池壁相同位置放入，这样大鼠从第2象限到第4象限的站台的直线游泳距离相等。在测试可视平台前，先将大鼠放到平台上30 s后，让其熟悉平台的新位置然后直接进行测试。可视平台试验只进行1个象限。结果以大鼠寻找站台游泳的潜伏期（时间）表示。
2.7 淋巴细胞凋亡在上海体育学院分子生物实验室进行。大鼠腹腔麻醉后，打开腹腔，在腹腔后壁找到腹主静脉，用真空抗凝管从腹主静脉一次采全血5 ml，备用。使用AnnexinV/PI双染法，流式细胞仪测试凋亡细胞数目，统计早期凋亡、晚期凋亡和凋亡细胞总数目。
2.8 统计分析采用SPSS13.0统计软件分析，统计结果以±s表示，计算数据用单因素方差分析，方差齐用LSD检验，方差不齐用Tambane's T2检验，P<0.05为有显著性差异，P<0.01有高度显著性差异。
3 结果
48只参与实验大鼠由于冷水游泳刺激，患肺炎病死亡3只，在束缚过程中窒息死亡6只，不明原因死亡1只，共死亡10只，最后38只大鼠进入实验采集血样标本，各项实验结果如下。