原阿片碱和别隐品碱对DNA拓扑异构酶I的抑制活性
作者：刘朝亮，程轩轩，王冬梅，杨得坡
【摘要】 目的研究原阿片碱（protopine）和别隐品碱（allocryptopine）对DNA拓扑异构酶I（TOPO I）活性的影响。方法 以pBluescript-II-KS(+) DNA为底物，采用琼脂糖凝胶电泳检测protopine和allocryptopine对TOPO I介导的pBluescript DNA解旋反应的影响。结果在同等浓度下（100 μmol/L），protopine和allocryptopine具有显著的TOPO I抑制作用，且抑制浓度与阳性对照药喜树碱相当。结论对TOPO I活性的抑制可能是protopine和allocryptopine体外抗肿瘤作用机制之一。
【关键词】 原阿片碱； 别隐品碱； 抗肿瘤； 拓扑异构酶I
原阿片碱（protopine）和别隐品碱（allocryptopine）为异喹啉类生物碱。据报道，二者均有抗心律失常［1， 2］、抗心肌梗塞的作用。Protopine还具有抑制血小板聚集［2］、抗脑缺血［3］、松弛平滑肌［2，4］、解痉止痛、保肝、抗疟等［2］多方面的药理活性。迄今为止，未见其抗肿瘤活性的报道。本实验研究了protopine和allocryptopine对DNA拓扑异构酶I（TOPO I）活性的影响，初步探讨其抗肿瘤作用机制。
1 材料与仪器
1.1 试剂及药品喜树碱（Camptothecin, CPT）购自美国Sigma公司。Protopine和allocryptopine为实验室自制，HPLC检测纯度>95%。
琼脂糖凝胶、β-巯基乙醇、溴乙锭（EB）、溴酚蓝、硼酸、甘油、苯酚、十二烷基硫酸钠（SDS）、二甲基亚砜（DMSO）、EDTA（ethylenediamine N, N, N', N'-tetraacetate）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin, BSA）、NaOAc、KCl、MgCl2均购自美国Sigma公司；Tris（Ultrapure）购自美国USB公司。pBluescript-II-KS (+) DNA （Stratagene, La Jolla, CA, USA）；DNA拓扑异构酶I（Human topoisomerase I, Sigma, USA）；蛋白酶钾（Proteinase K, Roche Applied Science, Mannheim, Germany）。
1.2 仪器中型水平电泳槽（MGU-502T，美国CBS）；Kodak凝胶成像系统（EDAS 290，120，USA）。
2 方法
在4 μl 5×反应缓冲液（35 mmol/L Tris-HCl pH 7.5, 50 mmol/L KCl, 5 mmol/L MgCl2, 3 mmol/L β-巯基乙醇, 0.1 mmol/L EDTA, 2 mmol/L spermidine, 50 μg/ml BSA）中加入0.5 μg pBluescript DNA、2 U TOPO I（1U TOPO I在pH 7.5， 37℃条件下，15 min内可以使0.25 μg的超螺旋质粒DNA完全解旋）及不同的受试药物，包括阳性对照药CPT和自制的生物碱（药物均溶解于少量DMSO中，终浓度为100 μmol/L），并加三蒸水至20 μl，置37℃反应30 min。加2 μl 10% SDS和1 μl蛋白酶K（10 mg/ml）终止反应，继续孵育1 h。最后加2 μl上样缓冲液（30 %甘油、0.25%溴酚蓝），0.9%琼脂糖（含0.5 μg/ml EB）电泳，0.5×TBE缓冲液，80V电压，电泳2 h，凝胶成像系统观察电泳条带并拍照。
3 结果
Protopine和allocryptopine对TOPO I酶活性的影响见图1。由图可知，生物碱allocryptopine、protopine具有显著的TOPO I抑制作用，且抑制强度与阳性对照药喜树碱相当。TOPO I抑制剂的药理机制主要是：它稳定了“药物-拓扑酶-DNA”三元复合物，妨碍了TOPO I介导的单链DNA切口的再连接。就是在药物作用下，TOPO I切开DNA单链，酶蛋白与末端DNA以共价键形成一种具破坏性的易解离的三元复合物，具有中毒效应的抑制剂使易解离复合物稳定和僵化，形成“路障”，使复制不能进行下去，从而导致DNA断裂和细胞死亡。一般来说，TOPO I抑制剂有两种作用机理［5, 6］：①特异性抑制：药物直接结合于拓扑酶-DNA复合物上，即药物几乎只与复合物作用且使复合物稳定存在，喜树碱就是该种作用机制。②非特异性抑制：药物直接与DNA嵌合，阻止拓扑酶作用于DNA，同样使复制无法进行下去。这两种作用方式可以通过电泳图谱中的缺口环状DNA带（Nick band）和超螺旋DNA带（Supercoiled band）的形成状态加以区分。