枸杞多糖对人食管癌细胞增殖的抑制作用及与Rb蛋白表达的关系
作者：单铁英， 刘宇宁， 杨书良
【摘要】 目的分析中药枸杞多糖(LBP)对食管癌细胞株TE13的生长抑制作用,探讨其诱导细胞凋亡和周期阻滞与Rb蛋白表达的关系。方法取对数生长期的人食管癌细胞TE13 ,接种于96孔培养板,分为实验组、阴性对照组和阳性对照组。实验组各孔加入不同浓度的LBP,阴性对照孔加入完全培养基,阳性对照孔加入化疗药物羟甲基喜树碱,应用MTT法检测LBP对TE13细胞的抑制作用;光镜下观察TE13细胞的形态学变化;流式细胞技术检测细胞凋亡率;免疫组化法检测TE13细胞经药物处理前后去磷酸化Rb蛋白表达的变化。结果LBP对TE13细胞增殖具有明显的抑制作用(P<0.01),其药物浓度越大,作用时间越长,抑制效应越强;LBP作用48 h时,对TE13细胞的半数抑制浓度( IC50) 为0.61 μg/ml。出现亚二倍体和凋亡峰(Ap);LBP能提高TE13细胞中Rb蛋白的表达(P<0.01)。结论LBP 能显著抑制TE13 细胞的增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与CPP 提高Rb 蛋白的表达有关。
【关键词】 枸杞多糖; 食管癌; Rb 蛋白
枸杞多糖(Lycium barbarumpolysaccharides ,LBP) 是枸杞子的提取物,具有多种生物活性作用［1］及抗肿瘤功能［2］,并能诱导肿瘤细胞凋亡从而抑制其增殖［3］。我国是食管癌高发区,河北省的涉县和磁县等地是食管癌集中高发区,发病率和死亡率呈逐年升高趋势。LBP诱导食管癌细胞株TE13的凋亡及其机制尚未见报道。本文旨在探讨(LBP) 对食管癌细胞株TE13凋亡的影响及其可能机制，为食管癌的防治提供新的途径及实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料人食管癌细胞株TE13 由本室提供。枸杞多糖由本校实验中心从宁夏优质枸杞子中分离提取，纯度超过99%。PI 染料、MTT试剂盒、SDS 购自美国Sigma 公司;胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司;RPMI1640 和胰蛋白酶购自美国GIBCO 公司。兔抗人去磷酸化Rb 单克隆抗体和山羊抗兔第二抗体均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 细胞培养TE13细胞以含100 ml/ L 胎牛血清的RPMI1640 培养液于37℃、5 % CO2 培养箱中培养,以0.25%的胰蛋白酶消化细胞传代, 取对数生长期细胞用于实验。
1.3 细胞增殖实验取对数生长期的TE13细胞,调整细胞浓度为1×105/ ml ,接种于96孔培养板,每孔100 μl(含1×104个细胞)。分为实验组、阴性对照组和阳性对照组。实验组各孔加入不同浓度的LBP各10 μl,使其终浓度分别为1 000，800，400，200，100 μg/ml;阴性对照孔加入完全培养基;阳性对照孔加入化疗药物羟甲基喜树碱(hydroxymethyl-camptothecin , HCPT) 10 μl ,终浓度为10 μg/ml;每组均设4个复孔。置于饱和湿度、37℃、5 % CO2培养箱中培养24，48，72 h后,各孔加入MTT(5 mg/ ml)20 μl ,继续培养4 h ,弃去培养上清,每孔加入DMSO 150 μl ,混匀后以波长492 nm,参考波长620 nm检测各孔光密度(OD)值, 按下式计算细胞抑制率及IC50:细胞生长抑制率(CI,%)=(对照组OD值- 实验组OD值)/对照组OD值×100%。
1.4 光镜下观察细胞形态LBP处理TE13 细胞48 h后,倒置相差显微镜下观察形态学变化。
1.5 流式细胞技术检测细胞周期和凋亡率分别以800，400，200 μg/ml的LBP作用于TE13 细胞48 h ,收集细胞,用预冷的70%乙醇固定12 h;离心弃固定液, PBS重悬5 min 后300 目筛网过滤; 加入PI 染液, 4 ℃避光染色30 min , 流式细胞仪(Beckman) 分析细胞周期及凋亡率。
1.6 细胞Rb 蛋白表达的检测取对数生长期的TE13 细胞, 调整细胞浓度为2×105/ml ,接种于6 孔培养板,每孔细胞悬液1 ml(含2×105个细胞) ,实验组各孔加入不同浓度的LBP各2 ml,使其终浓度分别为21 μg/ml;阴性对照孔加入完全培养基,培养48 h ,收集细胞,离心,常规细胞甩片,免疫细胞化学染色,采用SP法。在光学显微镜下观察,以胞浆出现棕黄色颗粒或胞膜棕黄色染色作为阳性细胞,在低倍镜下找到阳性细胞较为密集的区域,取连续4 个视野内计数Rb 阳性细胞总数,取平均值作为阳性细胞表达率。
1.7 统计学方法计量资料用±s表示, 采用单因素方差分析和两样本t检验; 两变量采用spearman线性相关分析。
2 结果
2.1 LBP对TE13 细胞增殖的抑制作用LBP对TE13 细胞有很强的抑制作用(P<0. 01) ,并呈明显时间和浓度依赖性。随着LBP 浓度的增加和作用时间的延长, 对细胞增殖的抑制作用明显增强(见表1)。LBP作用48 h时, 对TE13 细胞的半数抑制浓度(IC50) 为0.61 μg/ml 。表1 LBP对TE13细胞增殖作用的影响（略）
2.2 LBP 对TE13 细胞形态学的影响倒置显微镜下观察,对照组细胞呈贴壁生长,生长状态良好,细胞透明饱满,成多边形,颗粒较少,细胞间界限清楚,细胞核隐约可见;而经LBP处理的细胞,变圆、固缩,呈漂浮状态生长的细胞数量明显增加,细胞内部结构受到破坏,呈现碎片状,其存活细胞显著减少。