红芪多糖的纯化及初步结构鉴定

               作者：惠和平，封士兰，赵良功，石义凯，刘小花

【摘要】  　　目的研究红芪多糖的分离纯化及初步的结构。方法采用超声辅助提取多糖，比较 Sevag法、三氯乙酸法和三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白的效果，并用 GC、TLC及 IR分析多糖的初步结构。结果三氯乙酸-正丁醇法脱蛋白，经 Sephadex G-25柱层析分离纯化后得红芪多糖2(HPS-2)，HPLC确定为均一多糖，糖含量为 98.02%，糖组成分析表明其含有鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖和半乳糖，摩尔比为 0.3∶0.2∶2.7∶16.1∶2.0。结论HPS-2是一种以 β苷键为主的吡喃型杂多糖。

【关键词】  红芪多糖； 薄层色谱； 结构鉴定

　　红芪（Radix Hedysari）,为豆科岩黄芪属植物多序岩黄芪Hedysarumpolybotrys Hand.-Mazz的干燥根，为甘肃特产名贵药材，在临床上主要用于补气固表, 利尿托毒, 排脓, 敛疮生肌。红芪中含有氨基酸、有机酸、β-谷甾醇、红芪多糖、微量元素等众多的生物活性物质［1］。近年来研究发现，红芪多糖的活性成分具有增强机体免疫力、抗肿瘤、抗衰老、治疗糖尿病等作用［1，2］。特别是我们近几年的研究发现，经 70%乙醇沉淀部分药理作用尤为明显。由于多糖为大分子化合物，分离纯化比较困难，而蛋白质的脱除是后期结构鉴定的关键之一，为了提高多糖的得率、纯度及活性，本实验对这部分多糖进行了脱蛋白方法的研究，结合TLC、GC、IR等方法对 HPS-2 的结构进行了初步的分析，以期为红芪多糖的进一步研究提供理论基础。

　　1  材料与仪器
   
　　红芪，购自甘肃武都；牛血清白蛋白、考马斯亮蓝 G-250（西安周鼎国生物技术有限责任公司）；单糖对照品（中国药品生物制品检定所）；Sephadex G-25（上海长征制药厂）；硅胶 G（青岛海洋化工厂）；其它试剂均为分析纯。
   
　　CR22G Ⅱ型离心机（日本日立）；UV-1700 型紫外仪（日本岛津）；GC-Clarus 500型气相色谱仪（美国 PerkinElmer公司）；红外光谱仪（Nicolet NEXUS 670）；BS-100A 自动部分收集器、HL-2 恒流泵（上海沪西分析仪器厂有限公司）；美国Waters600型高效液相色谱仪，配 Waters2414型示差折光检测器。

　　2  方法
　　
　　2.1  红芪多糖的提取纯化路线其流程如下。

　　2.1.1  提取红芪药材→粉碎→超声脱脂→热水提取3次→合并提取液→减压浓缩后离心→取上清液→乙醇沉淀→有机溶剂洗剂→透析→减压浓缩→冷冻干燥得粗多糖 HPS。

　　2.1.2  纯化粗多糖液→脱蛋白、色素→Sephadex G-25柱层析→洗脱液透析→浓缩→冷冻干燥→精制红芪多糖 HPS-2。

　　2.2  蛋白质和多糖含量的测定蛋白质含量测定采用考马氏亮蓝法［3］，多糖含量采用苯酚-硫酸法［4］。
　　
　　2.3  脱蛋白方法 

　　称取一定量的粗多糖，加入适量蒸馏水，60℃加热溶解，备用。本实验采用 3种脱蛋白的方法。

　　2.3.1  Sevag法取粗多糖溶液，加入等体积的氯仿-正丁醇(V/V为 4∶1)试剂，混合振摇 30 min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。

　　2.3.2  三氯乙酸法取粗多糖溶液，加入多糖溶液体积 0.1倍量的三氯乙酸，低温(4℃)剧烈振摇 30 min，离心除去沉淀，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。

　　2.3.3  三氯乙酸-正丁醇法

　　取粗多糖溶液，加入等体积的三氯乙酸-正丁醇(V/V为 1∶10)试剂，振荡 10 min，静置分层，收集下层水溶液，透析后醇沉，冷冻干燥，即得脱蛋白多糖。

　　2.4  红芪多糖的精制将一定量的脱蛋白多糖，溶解于适量蒸馏水中。过氧化氢除色素，减压浓缩，经醇沉、离心、冷冻干燥得红芪多糖1(HPS-1)，取适量的 HPS-1，蒸馏水溶解后，Sephadex G-25柱分离，蒸馏水洗脱，流速 0.8 ml/min，每 3 ml收集1份，苯酚-硫酸法跟踪检测，绘制洗脱曲线，合并主峰流出液，减压浓缩至一定体积，冷冻干燥得 HPS-2。

　　2.5  纯度鉴定用 HPLC法，TSK-gel G2500PW色谱柱，示差折光检测器，流动相为双蒸水，流速 1.0 ml/min，检测器温度35℃，样品浓度4 mg/ml，进样量50 μl。同时取该样品溶液在 200～400 nm范围内进行紫外扫描。

　　2.6  气相色谱参照文献［5］，多糖样品经彻底水解后制备糖腈乙酸酯衍生物，以单糖的糖腈乙酸酯衍生物为对照品进行 GC分析。色谱条件: OV-101毛细管柱(50 m×0. 32 mm)，载气为N2 ,流速 5 ml/min，分流比 40∶1，FID氢火焰检测器，汽化室温度 250℃，检测器温度 280℃。程序升温:110℃(保持 5 min)→(5℃/min)→ 280 ℃(保持 20 min)。进样量 0.4 μl。

　　2.7  薄层色谱［6］取 15mg HPS-2，三氟醋酸彻底水解，水解产物溶于 1 ml蒸馏水中，以标准单糖为对照，分别取样品水解液和单糖对照液在含磷酸二氢钠的硅胶G薄层板上点样，上行二次展开，展开剂: 醋酸乙酯∶冰醋酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2(V/V)；自然风干后显色，显色剂: 苯胺-邻苯二甲酸溶液，烘箱中 105 ℃加热 5～10 min显色。

　　2.8  红外光谱测定 取 2 mg HPS-3，KBr压片，测定红外光谱。