当归对宫内缺氧后新生大鼠大脑CA3区神经元及NMDAR1mRNA表达的影响

                  作者：陈旭东 ，赵四敏， 华新宇， 余鸿 

【摘要】  　　目的探讨当归对宫内缺氧后新生大鼠大脑内N-甲基D-天冬氨酸受体亚单位NR1 (NMDAR1 mRNA)表达及神经元的影响。方法将孕期14d的SD大鼠随机分为对照组、缺氧组和当归治疗组。缺氧组孕鼠自孕第14天开始每天1次经尾静脉注射生理盐水8 ml/kg（连续7 d），后用低张性缺氧模型致胚鼠宫内缺氧2 h（连续3 d：孕期第14天、15天、16天）；当归治疗组用250 g/L的当归注射液代替生理盐水，其余处理同缺氧组；对照组不缺氧，其余同缺氧组。三组孕鼠分娩当日取脑组织、多聚甲醛固定，石蜡包埋切片NSE免疫组化、NMDAR1原位杂交神经元DAB显色、400倍拍照、IPP6.0软件图像分析。结果缺氧组新生鼠NSE阳性细胞表达较对照组减少 (P＜0.05)，而NMDAR1 mRNA的表达较对照组增加 (P＜0.05)；当归组NSE阳性细胞表达较缺氧组增加 (P＜0.05)，而NMDAR1 mRNA的表达较缺氧组减少 (P＜0.05)。结论当归注射液对宫内缺氧新生大鼠脑组织具有保护作用，其作用机制之一可能是与抑制NMDA R1 表达有关。

【关键词】  当归； 缺氧； 脑； NMDAR1

　　宫内缺氧是影响胚胎发育的常见因素，也是导致新生儿残疾和死亡的主要原因之一。然而，损伤后的神经系统能否及时修复、如何修复等显得非常重要。本小组前期研究表明当归可减弱缺氧时神经元的变性［1］，但是其机制如何？近年来研究发现，NMDA受体是兴奋性氨基酸的特异性受体，也是兴奋毒性的主要神经通路，从而发挥对脑缺血再灌注损伤的保护作用。但NMDA是否也参与宫内缺氧新生大鼠的神经系统的改变，其又扮演了怎样的角色？本实验试图建立在体宫内缺氧模型，预观察神经元的和NMDA的变化，以及当归对其是否有调控作用并探讨其可能机制。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料小鼠抗NSE（CHEMICON公司）、NMDAR1原位杂交检测试剂盒、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒(棕黄色) 购自武汉博士德生物工程公司；250 g/L的当归注射液购自武汉大学附属第二医院药剂科（批号：070823）；OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统为日本OLYMPUS光学仪器有限公司生产；德国莱卡切片机；三气培养箱（购自美国REVCO公司）。SD大鼠15只（220～250g）由泸州医学院动物实验中心提供。

　　1.2  动物配种与分组成年健康SD雌大鼠15只(体质量220～260 g)，分别与SD雄鼠合笼配种，次日晨见阴栓记为大鼠怀孕0d，孕鼠随机分为对照组、缺氧组、当归组各5只。

　　1.3  宫内缺氧模型建立当归组孕鼠自孕14 d开始，每天上午8：00经尾静脉注射250 g/L的当归注射液8ml/kg（孕14～20 d，连续7 d），1 h后放入三气培养箱(氧体积分数130 ml／L，温度25℃ ，二氧化碳体积分数0.4～0.6 ml／L)内缺氧2 h，连续缺氧3 d(孕第14～16天)，第17天、18天、19天、20天仍给予当归注射，但不缺氧。缺氧组用生理盐水代替当归注射液，其余同当归组。对照组不缺氧，余同缺氧组。

　　1.4  取材、石蜡切片及NSE免疫组织化学和NMDAR1原位杂交测定每只孕鼠分娩当天随机选取新生大鼠2只 ，每组得新生鼠10只， 取新生大鼠脑、40 g／L多聚甲醛固定60 min、常规石蜡包埋（试剂中均含1 ml/L的DEPC）、经海马冠状切面切片(厚4 μm)。脑组织切片作NSE免疫组化、NMDAmRNA原位杂交（步骤按说明书进行），切片常规脱水、透明、封片。采用OLYMPUS Bx-70荧光显微镜成像系统拍照，经Image-Pro Plus5.1图像分析系统对阳性细胞进行图像分析。

　　1.5  统计学处理各组间比较用方差分析，两两比较用LSD法检验。采用SPSS15.0软件包完成数据分析（P<0.05）。

　　2  结果

　　2.1  各组新生鼠脑CA3区NSE免疫组化染色结果对照组NSE免疫组化阳性细胞分布于锥体细胞层，分子层，多形细胞层，胞质染为棕黄色（见图1）；与对照组相比缺氧组阳性细胞染色减弱，数量减少（见图2）；与缺氧组相比当归治疗组阳性细胞染色增强，数量增多（见图3），各组积分光密度值见表1。表1  各组新生大鼠NSE和NMDAR1mRNA阳性细胞IOD值（略）

　　2.2  各组新生鼠脑CA3区NMDAR1 mRNA原位杂交结果NMDAR1 mRNA原位杂交阳性细胞分布在锥体细胞层，分子层，多形细胞层，胞质染为棕黄色，对照组阳性细胞浅染，数量少（见图4）；缺氧组阳性细胞染色明显增强，数量较对照组增多（见图5）； 当归组阳性细胞染色较相应缺氧组减弱，数量减少（见图6），各组积分光密度值见表1。
　
　　3  讨论
  
　　由于众多因素（如母体因素、脐带因素、胎儿因素等）的普遍存在，导致宫内缺氧的发病率较高，而且神经系统（尤其海马）是对缺氧损伤极为敏感的部位之一,可造成不同程度的脑组织损伤, 因此，宫内缺氧必然影响到胚胎海马神经元的生长发育，而神经元仅能生长没有分裂能力，故研究如何有效地挽救受损神经元有着重要意义。

　　胚胎时期神经元主要来源于神经干细胞的增殖和定向分化［2］，而神经干细胞的增殖受自身基因调控和外来信号调控两种机制的影响。氧浓度降低，复杂的细胞内氧感受系统迅速感受氧分压的变化，诱导适应性机制的出现，以最大程度地减少低氧对脑的损伤。其中关键性调节因子是低氧诱导因子HIF-1，它诱导多种基因表达，需要指出的是，神经系统对低氧最敏感，即使有HIF-1的调节，轻度低氧也可能影响神经元功能［3］。本实验中，观察到缺氧3 d（每天2 h）组新生大鼠免疫组化NSE表达比对照组减弱、阳性细胞减少，积分光密度值减小，说明胚胎海马的神经元出现了坏死和凋亡，导致神经元数量减少，经神经干细胞分化、补充，经缺氧后7 d的补充修复，到出生时神经元数量仍然明显少于对照组。而当归治疗组新生鼠大脑NSE免疫反应阳性细胞的积分光密度值较相应缺氧组增多， 说明当归注射液减弱了缺氧对神经元的损伤，起到了保护作用。