丹芪合剂和依那普利对糖尿病大鼠肾小管HGF和SnoN表达的影响

             作者：李晓颖，郭兵，刘瑞霞，肖瑛，石明隽，王圆圆，皮明婧，张国忠 

【摘要】  　　目的观察丹芪合剂和依那普利对糖尿病大鼠肾小管HGF和SnoN表达的影响。方法SD大鼠随机分为4组：正常对照组（N组），糖尿病组（D组），中药丹芪合剂治疗组（Y组），依那普利治疗组（E组）。采用链脲佐菌素尾静脉注射（55 mg/kg）的方法复制糖尿病模型。生化方法测血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、胆固醇，并计算肾脏指数。HE染色光镜检查肾组织形态学变化。免疫组化观察大鼠肾脏SnoN、HGF、TGF-β1、FN蛋白表达情况，Western blotting检测大鼠肾脏SnoN、HGF、TGF-β1蛋白的表达。结果①D组肾脏指数、血糖、24 h尿蛋白、血肌酐、甘油三酯、胆固醇较N组明显升高；Y组和E组与D组大鼠相比，血肌酐、24 h尿蛋白量及甘油三酯显著降低。②D组大鼠出现明显的肾脏形态学改变，Y组和E组明显改善。③免疫组化和Western blotting结果显示：D组大鼠SnoN和HGF较N组明显降低，Y组和E组明显高于D组；D组TGF-β1和FN明显高于N组，Y组和E组则较D组明显下降。结论丹芪合剂和依那普利可能通过促进HGF生成，从而抑制TGF-β1的产生，以及促进SnoN表达进而抑制TGF-β1/Smad信号通路，使糖尿病肾病得到改善。

【关键词】  糖尿病肾病； 肝细胞生长因子； SnoN； 丹芪合剂； 依那普利

　　糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病（diabetic mellitus, DM）最常见的严重并发症之一 ，发病机制复杂，治疗也很困难，最终发展为终末期肾衰竭（ESRD），严重威胁人类健康。转化生长因子β1（transforming growth factor beta1, TGF-β1）是目前公认的与肾脏肥大和肾间质纤维化密切相关的细胞因子，通过下游Smads通路发挥作用。近年来研究发现［1］，转录共抑制因子SnoN是TGF-β1/Smad信号通路重要的负性调节因子，它可与Smads蛋白相互作用，抑制TGF-β1靶基因的活化，从而调控TGF-β1的生物效应。我们近期的研究表明［2］，DN时SnoN蛋白的表达明显降低，对TGF-β1/Smad信号通路的负调控作用减弱，从而促进DN的发生发展。据报道［3］，肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）为内源性的肾脏保护因子，在肾小管上皮细胞中可介导SnoN生成，从而抑制TGF-β1/Smad信号通路，减缓肾纤维化进展。我们以往的研究表明［4，5］，丹芪合剂和依那普利对肾纤维化有一定的治疗作用，但其作用机制未充分阐明。本研究旨在观察丹芪合剂和依那普利是否通过调节肾小管HGF、SnoN的表达而起到改善DN的作用。      

　　1  材料与仪器

　　1.1  药物和试剂链脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)购自Sigma公司；血糖、肌酐、甘油三酯、胆固醇检测试剂盒购自迈克公司，尿蛋白检测试剂盒购自南京建成公司；兔抗鼠SnoN多克隆抗体购自SantaCruy公司；兔抗鼠HGF、TGF-β1和FN多克隆抗体，β-acting单克隆抗体，免疫组化SABC试剂盒，辣根过氧化物酶标记的二抗，ECM显色试剂盒均购自武汉bostor公司，DAB显色剂，SP试剂盒购自北京中杉金桥公司；Western印迹所用PVDF膜、3 mm Whatman滤纸购于美国milli-pore公司；依那普利，扬子江制药厂生产；丹芪合剂为丹参、黄芪、生地黄等中药的自制提取液。

　　1.2  器材美国强生血糖仪；高速低温离心机（Beckman公司）；核酸蛋白分析仪（Amersham公司）；电泳系统及电转移装置（Amersham公司）；凝胶成像系统（美国Bio-RAD公司）。

　　2  方法

　　2.1  动物及分组雄性SD大鼠48只，体质量180～220 g，购于上海实验动物中心。随机分为4组，每组12只：正常对照组(N组)、糖尿病组(D组)、糖尿病丹芪合剂治疗组(Y组)和糖尿病依那普利组(E组)。用0.1 mmol/L，pH 4.0 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液将链脲佐菌素(STZ)配成5%的溶液，D组、Y组、E组按55mg/kg的剂量单次尾静脉注射，N组大鼠尾静脉注射0.2 ml等量柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。48h后尾静脉采血测量空腹血糖值，大于或等于16.7者为糖尿病大鼠模型。除N组外所有动物全部成模。各组大鼠均喂食颗粒饲料，自由饮自来水，成模第2日起，Y组大鼠给予丹芪合剂灌胃1.8 g/（kg·d），E组大鼠依那普利灌胃2 mg/（kg·d），N组和D组大鼠1.5 ml自来水灌胃。

　　2.2  血、尿及肾脏标本的采集大鼠饲养12周后处死，处死前称体质量，代谢笼收集24 h尿量并计量，-20℃保存。股动脉取血，离心分离血清，-20℃保存。空腹8 h后处死动物，生理盐水充分灌洗肾脏，滤纸吸干后称重，一侧肾固定于4%多聚甲醛中供石蜡切片用，另一侧肾脏于-80℃保存供Western blotting检测用。

　　2.3  肾脏指数及生化检测肾重与体重之比为肾脏指数（kidney index，KI）；氧化酶法测血糖（blood glucose，BG）；考马斯亮蓝法测尿蛋白浓度，乘以24 h尿量即24 h尿蛋白量(24 h urine protein，24 hUP)；碱性苦味酸法测血肌酐(serum creatinine, SCr)；超微量酶法检测总胆固醇(cholesterol，Ch)；GPO-PAP法检测甘油三酯(triglyceride, TC)。

　　2.4  肾组织形态学观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，HE染色后光镜观察肾组织形态学变化。

　　2.5  免疫组化法观察多聚甲醛固定的肾脏组织行石蜡切片，用免疫组化SP法检测各组大鼠肾皮质中SnoN和HGF表达，一抗浓度分别为1∶100、1∶200，用SABC法检测各组大鼠肾皮质中TGF-β1和FN，一抗浓度为1∶100、1∶50，阴性对照用PBS代替一抗。DAB显色，苏木素复染。SnoN、HGF、TGF-β1在高倍镜（400×）下随机计数10个不重复视野，对染成棕黄色的肾小管数进行统计，取均值；FN在显微镜测微尺（0.5网形目镜尺）下随机计数十字交叉点与FN阳性染色表达重合的点数，计数10个视野（400×），取均值。

　　2.6  Western blotting 检测-80℃保存的各组大鼠肾皮质，每组100 mg，蛋白裂解液提取总蛋白，BCA法定量。蛋白质样品经12%的SDS-PAGE凝胶电泳分离，再转移至PVDF膜上，SnoN、HGF、TGF-β1、β-actin一抗工作浓度分别为1∶200，1∶400，1∶200，1∶300，凝胶成像系统扫描成像，Quantity one图像分析，SnoN、HGF、TGF-β1与同一张胶相应的β-actin条带所测积分灰度值的比值，即相对积分灰度值。

　　2.7  数据分析所有数据以±s表示，采用SPSS11.5软件分析，组间数据差异比较采用单因素方差齐性检验，用One-way ANOVA分析，P<0.05为显著差异。

　　3  结果

　　3.1  肾脏指数及各生化指标变化D组较N组大鼠，肾脏指数、血糖、24 h尿蛋白量、血肌酐、胆固醇、甘油三酯均明显升高（P＜0.01）。Y组和E组，尿蛋白、血肌酐及甘油三酯显著降低（P＜0.05），但血糖和肾脏指数无明显改善。结果见表1。表1  各组大鼠的肾脏指数、血糖浓度、24h尿蛋白量、血肌酐、胆固醇、甘油三酯水平(略)

　　3.2  肾组织形态学变化HE染色可见，正常组大鼠肾脏肾小球形态完整、轮廓清晰，肾小管未见异常。糖尿病大鼠肾小球增大，系膜区基质沉积增多，肾小管上皮细胞肿胀，空泡变性及基底膜增厚。经丹芪合剂和依那普利治疗后，形态明显改善。

　　3.3  免疫组化结果N组肾小管上皮细胞有较多HGF表达，D组表达减少，Y组和E组表达较D组明显增加；肾小管上皮细胞SnoN表达D组较N组明显减少，Y组和E组较D组表达明显增加；TGF-β1在N组几乎无表达，D组肾小管上皮细胞有较多表达，Y组和E组明显降低；FN沿肾小管基膜表达，N组表达较少，D组表达明显增加，治疗组较D组显著降低。各指标在两治疗组之间无统计学差异。结果见图1和表2。表2  各组大鼠肾组织中HGF、SnoN、TGF-β1、FN蛋白表达的情况(略)

　　3.4  Western blotting 结果HGF蛋白N组大鼠表达较多，HGF与β-actin的积分灰度值之比为（0.86±0.16），D组下降明显，为N组的61.6%（0.53±0.08），Y组和E组明显增高，分别为N组的91.9%和89.8%（0.79±0.07，0.77±0.11）；SnoN蛋白N组大鼠表达较多，SnoN与β-actin的积分灰度值之比为1.19±0.12，D组下降明显，为N组的66.3%（0.79±0.09），Y组和E组明显升高，为N组的89.9%和89.8%（1.07±0.05，1.06±0.16）；TGF-β1蛋白N组大鼠表达较少为（0.05±0.01），D组为0.70±0.12，Y组和E组为D组的55.7%和54.3%（0.39±0.06，0.38±0.04）。结果见图2。