豆根管食通口服液对人食管癌细胞端粒酶活性影响的实验研究

　　3  结果

　　用2×IC50、1×IC50和0.5×IC50豆根管食通处理Eca-109细胞不同时间后，分别检测Eca-109细胞端粒酶的活性，以波长450 nm和630 nm处吸光度的差值△A代表端粒酶的活性。用2×IC50、1×IC50和0.5×IC50的豆根管食通处理Eca-109细胞48 h后，端粒酶活性下降，与正常对照组相比差异有统计学意义(P﹤0.01)；尤以大剂量2×IC50作用更为明显，与0.5×IC50小剂量组相比，差异有统计学意义(P﹤0.01)。表明2×IC50的豆根管食通,长时间(48 h)作用于Eca109细胞后，可明显下调其端粒酶的表达。阳性对照△A为（1.72±0.06）。结果见表1及图1。表1  豆根管食通作用Eca-109细胞不同时间对端粒酶活性的影响（略）

　　以2倍IC50、1倍IC50 及0.5倍IC50的豆根管食通口服液培养食管癌Eca-109细胞24，48，72 h后，其端粒酶活性与对照组相比均有非常显著性差异，P﹤0.01；
   
　　以上述不同浓度的豆根管食通口服液培养食管癌Eca-109细胞12 h检测端粒酶活性，2倍IC50、1倍IC50药物组与对照组比具有非常显著性差异，P﹤0.01，而0.5倍IC50的豆根管食通口服液则无显著性差异，P﹥0.05；

　　从结果可看出，随着药物作用时间的延长（12～48 h），端粒酶活性表达呈现线性下降趋势，统计结果表明P﹤0.01，说明存在着时效关系，而到了72 h则这种时效关系不复存在；
   
　　3个剂量中药培养食管癌Eca-109细胞至相同时间段，其端粒酶活性表达显示出一定的量效关系，在0.5倍至2倍IC50之间，呈现出正相关。

　　4  讨论
   
　　根据食管癌出现吞咽之时梗噎不顺，饮食不下，或食入即吐的临床症候分析，食管癌应属中医“噎膈”病范畴。我们认为邪郁蕴毒及痰瘀互结是形成食管癌的主要病因病机。由于忧思郁怒等情志因素以及饮食不节、酒食所伤致使痰气交阻，日久邪气渐盛，痰瘀互结于食道蕴为癌毒而发本病。正如徐灵胎曰“噎膈之证，必有瘀血、顽痰、逆气，阻隔胃气”。另外，内虚亦是食管癌发病的关键因素，即所谓“正气存内，邪不可干；邪之所凑，其气必虚”。这里所讲的“虚”并非指体虚的各种外在表现，而是指机体存在内在的对疾病的易感因素。所以食管癌发病的根本原因是患病机体在病变之前，已存在阴阳不和，脏腑失调，正气亏虚等潜在因素，加之情志，饮食等外因长期刺激，使阴阳失调更甚，脏腑功能极度混乱，正气愈加亏虚，最终导致痰瘀互结于食道而生癌毒。痰瘀日久化热伤阴，胃津亏耗而损及肾阴，皆属于噎膈重证，倘若病变继续发展，由阴损导致阳虚，则肾之精气皆亏，必致形体羸瘦，病情危笃。
   
　　针对食管癌痰瘀互结于食道形成癌毒的主要病机，我们以解毒豁痰化瘀为基本治法并结合现代药理研究，精心遣药组方而成了豆根管食通口服液，该口服液由山豆根、制南星、姜半夏、急性子、黄药子、郁金、沉香、三七等药物组成。方中山豆根解毒散结消肿为君药；制南星温化顽痰、姜半夏化痰散结降逆、急性子软坚散结消瘀、黄药子解毒散结消癥、郁金活血行气、沉香行气降逆，共为臣药；三七散瘀消肿止痛为佐使药。共奏解毒散结、豁痰化瘀之功效。适用于中医辨证为痰气交阻、瘀血内结及痰瘀互结型的食管癌患者。现代药理研究证明，山豆根对人食管癌细胞株(Eca-109)的杀伤能力随药物作用时间的延长而增强，使谷氨酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶、乳酸脱氢酶活性下降，直至阴性反应，并能减缓细胞周期进入M期细胞数值，从而影响细胞周期［3］；此外，山豆根还有抑菌、抗炎、升高白细胞、免疫抑制、保肝、促进溃疡修复及抗心律失常等作用。生南星中的D-甘露醇结晶有抑瘤活性。体外对Hela细胞有抑制作用，对小鼠实验性肿瘤包括肉瘤S180，HCA实体型，鳞状上皮子宫颈癌都有明显的抑制作用［4］。另外其药理作用还有祛痰、镇静镇痛、抗心律失常、凝集红细胞等作用。半夏提取物对腹水型肉瘤、肉瘤-180，实验性小鼠宫颈癌-14、肝癌实体型及Hela细胞、JTC-26体外实验均有一定的抑制作用［5］。从半夏中提取到的多糖具有较强的网状内皮激活活性［6］，能增强网状内皮系统吞噬功能和分泌作用，抑制肿瘤的发生和增殖。用2%黄药子油剂治疗食管癌奏效快，开道作用明显［7］，药理研究它还有抑菌、抗病毒、止血等作用。郁金有调节免疫功能、抑制中枢神经、改善血液流变学、抗自由基损伤及保肝、镇痛等作用［8］。三七现代药理学研究认为其具有改善微循环、消炎、预防肿瘤等作用［9］。有报道，三七可通过降低EGFR、C-erbB-2、H-ras、Bcl-2等癌基因的异常表达发挥治疗胃癌前病变的作用［10］。
   
　　豆根管食通口服液是国家级的科研课题。本课题前期的研究已经证实该口服液可引起肿瘤细胞凋亡，其抗肿瘤细胞毒作用与诱导肿瘤细胞发生凋亡有密切联系。端粒酶是近年来发现的一种特殊的逆转录酶，是由RNA和蛋白质组成的蛋白复合体。它的作用是在复制期(S期)的线性染色体末端添加TTAGGG重复片段，以弥补染色体由于细胞分裂出现的末端进行性缩短，而使细胞无限增殖，导致肿瘤的发生和细胞永生化［11］。端粒酶与细胞凋亡间存在密切关系，可能参与了凋亡的调控。由此，我们推测豆根管食通口服液抗肿瘤的分子机制可能与端粒酶活性改变有关。MTT结果显示豆根管食通口服液对Eca-109细胞的生长有明显的抑制作用，且在一定的浓度范围内存在剂量依赖性。各实验组与正常对照组OD值的差异有统计学意义(P<0.05)，且在一定的浓度范围内存在剂量依赖性。其IC50值为(62.14±2.23)mg/ml，其最佳抑瘤浓度约为150 ～200 mg/ml之间。实验中采用Roche公司的TRAP-PCR-ELISA试剂盒，定量检测了应用2×IC50，1×IC50和0.5×IC50豆根管食通处理Eca-109细胞48 h后，端粒酶活性下降，与正常对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)；尤以大剂量2×IC50作用更为明显，与0.5×IC50小剂量组相比，差异有统计学意义(P<0.01)。表明2×IC50的豆根管食通，长时间(48h)作用于Eca-109细胞后，可明显下调其端粒酶的表达。

　　5  结论

　　食管癌的主要病因病机为情志失调，饮食不节等在机体正气不足的基础上阻碍气机，酿痰生瘀，导致痰瘀互结于食道而生癌毒。治疗当以解毒散结，豁痰化瘀为原则。豆根管食通口服液为谨据病机，专为痰瘀互结之食管癌而设。临床及动物实验表明，该药物对食管癌有较好的疗效；豆根管食通口服液在体外具有明显抑制Eca-109细胞的作用，与药物浓度呈正相关，和化疗药物5-Fu联用有联合增效作用；在一定的浓度范围内，豆根管食通口服液可下调Eca-109细胞的端粒酶活性，且存在量效关系的相关性，以及一定时间的时相相关性；抑制端粒酶活性、诱导肿瘤细胞凋亡可能是豆根管食通口服液的抗癌机制之一；本实验研究揭示了豆根管食通口服液防治食管癌的部分机理，为该药的进一步临床应用提供了客观的理论依据。

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