豆根管食通口服液对人食管癌细胞端粒酶活性影响的实验研究

【摘要】  　　目的观察豆根管食通口服液体外对Eca-109细胞毒性及端粒酶活性的影响，从细胞分子水平探讨该药的作用机制。方法实验选择人Eca-109细胞株，采用MTT分析法，测定不同浓度豆根管食通口服液单用及与5-氟脲嘧啶(5－Fu)合用对Eca-109细胞的直接细胞毒作用；采用端粒重复序列扩增法(TRAP)、酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测端粒酶的活性变化。结果①豆根管食通口服液对Eca-109细胞的细胞毒作用：MTT结果显示对Eca-109细胞的生长有明显的抑制作用，各实验组与正常对照组OD值的差异有统计学意义，且在一定的浓度范围内存在剂量依赖性。②豆根管食通口服液对Eca-109细胞端粒酶活性的影响 采用TRAP-PCR-ELISA法检测端粒酶活性， 1倍及2倍的IC50豆根管食通口服液与对照组相比存在非常显著性差别；24 ～72 h各实验组和端粒酶阳性对照组相比均有非常显著性差异（P﹤0.01）；3个剂量中药培养食管癌Eca-109细胞至相同时间段，其端粒酶活性表达显示出一定的量效关系，在0.5倍至2倍IC50之间，呈现出正相关。结论①豆根管食通口服液在体外具有明显抑制Eca-109细胞的作用，与药物浓度呈正相关；②在一定的浓度范围内豆根管食通口服液可下调Eca-109细胞的端粒酶活性；③抑制端粒酶活性可能是豆根管食通口服液的抗癌机制之一。

【关键词】  豆根管食通口服液； Eca-109细胞； 食管癌； 端粒酶

　　食管癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一。中国是世界上食管癌的高发国家，也是目前世界上食管癌死亡率最高的国家，平均年死亡率为17.38/10万，居恶性肿瘤死亡的第四位，在河南省更是位居恶性肿瘤之首［1］，目前治疗仍以手术、放化疗为主要手段，其临床治疗效果不甚满意，5年生存率不到15%［2］，而中医药在肿瘤的综合治疗中具有独特的优势。现代研究认为，食管癌的形成既非单纯环境所致，也非仅仅遗传素质所为，而是发生在食管上皮单纯增生、不典型增生、原位癌、浸润癌整个自然病史中的多因素、多阶段、多基因变异累积及其相互作用的复杂过程。以分子生物学的观点认识疾病，可以说，疾病都是以症状为表型，直接或间接地与基因相关的基因病。食管癌的发生和演进除了涉及多个癌基因、抑癌基因的异常外，还存在另一非常重要的生物学特性，即以细胞的永生化来维持它的无限生长。端粒与端粒酶在近年已受到国际生物学界高度重视，是肿瘤研究的热点之一，它们与细胞衰老、分裂、永生化和癌变有密切关系。端粒酶的激活与食管癌的发生发展密切相关，并可能为食管癌的治疗提供新途径。我们采用端粒重复序列扩增法(TRAP)，酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测了豆根管食通口服液对人食管癌Eca-109细胞端粒酶活性的影响。
   
　　目前，端粒及端粒酶已被广泛认为可作为肿瘤的标记物以及抗肿瘤治疗的靶点，对于端粒和端粒酶的进一步深入研究，不仅有助于人们更好地理解肿瘤发生的可能机制，而且可为人们通过检测端粒酶的活性来预测细胞的恶变倾向，以及抑制端粒酶的活性而进行肿瘤治疗提供了一个良好的途径。

　　1  材料与仪器

　　1.1  试剂RPMI-1640培养粉，美国GIBCO公司产品；胎牛血清(FBS，200ml/瓶)，天津TPD血液研究所产品；四甲基偶氮哇盐［3-(4,5-dimethylthiazol)-2,5-diphenylte-2H- tetrazoliumbromide,MTT ］，瑞士Fluka产品；二甲基亚砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO），天津市登峰化学试剂厂产品；5-氟尿嘧啶注射液(5-Fu)：上海旭东海普药业有限公司产品（250 mg/10 ml），批号：031002，实验前配成所需浓度；多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine )，北京中山生物技术有限公司产品。聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-100)，美国Sigma产品；浓缩型3, 3'一二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)试剂盒，北京中山生物技术有限公司产品；端粒酶PCR-ELISA检测试剂盒(Telo TAGGG Telomerase PCR ELISAILUS )，德国Roche公司产品。

　　1.2  仪器烘箱、96孔培养板、24孔培养板，美国Costar公司产品；微量移液器，芬兰Biohit公司产品；CO2培养箱，美国Forme公司产品；超净工作台，苏州净化设备厂产品；显微镜：倒置显微镜，重庆光学仪器厂产品，光学显微镜，XSZ-G型，重庆光学仪器厂产品；低速大容量多管离心机LXJ－HB型，上海安亭科学仪器厂产品；GL－20G－H型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；TGL－16G型高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂产品；AE240双量程分析天平，梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品；酶标仪，美国Bio-Rad公司产品；ZD-85型恒温震荡器，常州国华电器有限公司产品；NO－11型PCR扩增仪，德国Biometra公司产品；SZ-93自动双重纯水蒸馏器，上海亚荣生化仪器厂产品。

　　1.3  细胞系人食管癌Eca-109细胞系由河南省医学科学研究所提供。

　　1.4  豆根管食通口服液复方中药制剂，河南中医学院第一附属医院制剂中心提供，10 ml/支(相当于含生药1g/ml)，批号(20030716)。实验前以蒸馏水配成所需浓度。过滤除菌，4℃存放。

　　2  方法

　　2.1  豆根管食通口服液对Eca-109细胞的体外细胞毒作用

　　2.1.1  细胞培养Eca-109细胞贴壁生长于RPMI－1640培养液中，内含10%胎牛血清，青霉素100 U/ml，链霉素100 μg/ml，于37℃，5%CO2饱和湿度孵箱中培养。2～3 d换液传代一次，取对数生长期细胞作后续实验。

　　2.1.2  MTT法测定药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用取对数生长期Eca-109细胞5×104/ml单细胞悬液接种于96孔板，加入不同浓度的豆根管食通口服液，每孔100 μl，每组4个平行孔，培养48 h后，弃去旧液，加入10%培养液，每孔170 μl，并分别加入不同浓度的实验药物，每孔30 μl，每孔终体积为200 μl。实验随机分4组：①单药实验组：加入豆根管食通口服液，终浓度为含生药25，50，100，150，200 mg/ml；②阳性对照组：加入5-Fu，终浓度为100 μg/ml；③联合用药组：两个剂量的豆根管食通口服液（终浓度为25，50 mg/ml）和终浓度为25 μg/ml的5-Fu按1∶1合用；④空白对照组：加入等体积的生理盐水；另设本底对照孔（于无细胞孔内加入等体积相应浓度的药物）。每组设4个平行孔，重复实验5次(n=20)。置37℃，5%CO2培养箱中培养48 h，每孔加入MTT液（5 mg/ml）20 μl，继续培养4 h，弃去孔内培养液，加入DMSO 200 μl，振荡器振荡10 min，用酶联免疫检测仪于570nm波长处测定各孔的光吸收值（OD值），按下式求出生长抑制率，并以IC50反映细胞对药物的敏感程度。细胞抑制率=（1-实验组OD均值/空白对照组OD均值）×100%。IC50为抑制细胞生长达到50%时药物浓度，利用概率单位法求得。
    
　　MTT分析法原理：MTT是一种能接受氢原子的染料，活细胞线粒体中存在与NADP相关的琥珀酸脱氢酶，能使外源性黄色的MTT还原为不溶性的蓝紫色结晶物Formazan，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能，DMSO能溶解细胞中的Formazan，因此测定其在570 nm处的OD值与活细胞数目成正比。以同一药物不同浓度对细胞的存活率作图，可得剂量反应曲线，求出IC50值。

　　2.2  Eca-109细胞中端粒酶活性的测定试剂盒购自Roche公司，按说明书进行以下操作。

　　2.2.1  RNA酶污染的控制方法实验用玻璃器皿使用前200℃干烤4 h。实验用水及塑料器皿用RNA酶抑制剂DEPC(0.1%)于37℃至少处理12 h。用高压灭菌的DEPC去离子水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液，干烤过的药匙称取试剂，将溶液装入无RNA酶的玻璃器皿。溶液用RNA酶抑制剂DEPC(0.1%)于37℃至少处理12 h，然后100℃加热15 min或12磅高压蒸气灭菌15 min。在准备分离和分析RNA研究专用的材料和溶液时，以及在涉及RNA的一切操作中，都应带一次性手套，进行RNA实验应勤换手套。

　　2.2.2  端粒酶提取物的制备端粒酶的抑制效应：取2×IC50，1×IC50，0.5×IC50的豆根管食通药液加入96孔细胞孔中。每个浓度设16个复孔，阳性对照的模板为含8个端粒重复序列的DNA片段，阴性对照为生理盐水加1 μg/ml RnaseA 37℃孵育20 min，依次在12，24，48，72 h分别取4孔收集细胞(约5×105个)，PBS洗3次，加入200 μl裂解液，充分混匀，4℃裂解30 min，1 500 r/min离心10 min，小心地将上清(约150 μl)移至另一洁净管中，-70℃保存备用或即用。

　　2.2.3  TRAP-PCR-ELISA实验 

　　取上述提取液3 μl，加入25 μl反应混合物(包括dNTP，Taq酶，生物素标记的引物Ⅰ、引物Ⅱ)，用无菌DEPC水补充至体积50 μl，在PCR扩增仪上运行。引物延伸：25℃反应30 min；预变性，94℃ 5 min；扩增反应：94℃ 30 s、50℃ 30 s、72℃ 90 s，循环30次；72℃后延伸10 min。取2.5 μl PCR产物加入10 μl变性液混匀，置室温10 min，加100 μl杂交液，转移到抗生素蛋白包被的酶标板中，37℃摇床杂交2 h；洗板3次，每次每孔250 μl洗板缓冲液；加入偶联过氧化物酶的地高辛抗体100μl，室温孵育30 min；洗板3次，每次250 μl；最后加入100 μl POD的底物TMB，显色10 min，在酶标仪上测吸光度A值，波长为450 nm和630 nm，吸光度差值：△A=A450-A63O，△A值代表细胞端粒酶活性。

　　2.3  统计学处理数据用统计分析软件SPSS12.0 for Windows处理，计量资料所有数据以±s表示，使用多个样本均数比较的单因素方差分析法。