软坚消瘿汤对自身免疫性甲状腺炎凋亡蛋白Fas/FasL、Bcl-2／Bax表达的影响
【摘要】 目的观察软坚消瘿汤对实验性自身免疫性甲状腺炎(EAT)大鼠的自身抗体、凋亡蛋白Fas／Fasl，Bcl-2／Bax的影响，从凋亡调控蛋白角度探讨其作用机制。方法运用甲状腺球蛋白与弗氏佐剂混合免疫注射法，联合饮用高碘水模拟大鼠实验性自身免疫性甲状腺炎。酶联免疫法检测甲状腺自身抗体、免疫组化染色法检测大鼠甲状腺细胞Fas／FasL，Bcl-2／Bax变化。结果软坚消瘿汤能显著降低自身免疫性甲状腺炎（EAT）大鼠血清自身抗体、降低甲状腺细胞Fas／FasL， Bax表达，增加甲状腺细胞Bcl-2表达。结论软坚消瘿汤可能通过降低EAT血清中自身抗体水平，抑制Fas／FasL、Bax表达，提高滤泡上皮细胞Bcl-2表达从而起到减轻甲状腺细胞凋亡的作用。
【关键词】 软坚消瘿汤; 实验性自身免疫性甲状腺炎; Fas／FasL; Bcl-2／Bax
细胞凋亡为细胞程序性死亡过程，在EAT中发挥重要作用。Fas／FasL凋亡蛋白促进凋亡发生，Bax、Bcl-2中前者促进凋亡，后者抑制凋亡。本实验旨在从凋亡蛋白角度揭示软坚消瘿汤治疗自身免疫性甲状腺炎机理。
1 材料与仪器
1.1 动物SPF级SD雌性大鼠，体质量（110±10）g， 4～6周龄，购于沈阳医学院实验动物中心。合格证号：SCXK（辽）2003-0016。
1.2 仪器
酶标仪（奥地利）型号：Anthos 2010；37℃电热恒温培养箱（上海博讯医疗设备公司）型号：HXP-9052MBE; 离心机（法国Jouan）型号：C4-12;微量移液器（美国热电）；电子秤（上海精密仪器有限公司）型号：JY5022。
1.3 主要药品及试剂
1.3.1 造模药品及试剂盒甲状腺球蛋白（TG）、弗氏佐剂(美国SIGMA公司)，甲状腺球蛋白抗体（TGAb）、甲状腺过氧化物酶抗体（TPOAb）等酶联免疫检测试剂盒（美国 ADL公司），Fas抗体、FasL抗体、Bax抗体、Bcl-2抗体、免SP试剂盒、DAB试剂盒等免疫组化试剂盒（北京博奥森有限公司）。
1.3.2 观察药品雷公藤多苷片，江美通制药有限公司产品,购于辽宁中医药大学附属医院药局；软坚消瘿汤中药饮片购于辽宁中医药大学附属医院中草药局。
2 方法
2.1 动物模型建立及分组SPF级SD雌性大鼠60只，适应性喂养1周，按体质量层次随机取15只为正常对照组，剩余为造模组。第2周起造模组饮用高碘水浓度为500 g/L［1］，正常对照组予蒸馏水。第4周起造模组于双后足皮下多点注射由完全弗氏佐剂(CFA)充分乳化成油包水状的TG（TG∶CFA=1∶1），共两次，中间间隔两天，每次每只含TG100 μg［2］，作为初次免疫，第5周于后背皮下多点注射由不完全弗氏佐剂(IFA)乳化的TG，每次每只含100 μg，每周1次，连续4周，作为加强免疫。第8周结束时成模。将成模后的大鼠随机分为模型对照组（13只）、西医治疗组（13只）、中药治疗组（14只）。
2.2 给药方法给药剂量按人和动物体表面积折算的等效剂量比值表,计算出大鼠等效灌胃剂量。软坚消瘿汤组每只大鼠灌胃量为10 ml·kg-1·d-1，生药含量2.03 g/ml。西药组予雷公藤多苷片，研磨，温开水配成悬浊液（2.37 g/ml）等量灌胃。模型组及正常对照组灌服等量蒸馏水。4组均每天给药1次，连续6周。
2.3 检测指标及方法
2.3.1 抗体及细胞因子各组实验大鼠于治疗后第42天腹主动脉取血并处死，离心1 500 r/min获取血清，采用ELISA检测TGAb, TPOAb。
2.3.2 凋亡蛋白大鼠处死，取双侧甲状腺，按试剂说明常规免疫组化制片，双盲显微镜观察凋亡蛋白Fas、FasL 、Bax、Bcl-2阳性表达位置，Mias99 病理图像分析系统,定标为μm，检测灰度值。
2.4 统计方法采用SPSS17·0统计软件,数据满足正态性和方差齐性，组间采用方差分析,所列数据采用 ±s表示。
3 结果
3.1 Fas、FasL、Bax、Bcl-2在甲状腺细胞表达Fas、FasL、Bax、Bcl-2阳性表达主要定位于细胞膜及胞浆,均呈棕黄色或棕褐色颗粒样分布。
正常组:无明显淋巴细胞浸润，未见浆细胞，滤泡上皮细胞低水平表达Fas及FasL、 Bax,阳性率及着色均低;高水平表达Bcl-2，阳性率及着色均高; 模型组：明显淋巴细胞及浆细胞浸润，浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞的细胞膜及胞浆内高水平表达Fas及FasL 、Bax,阳性率与着色程度均高, 低水平表达Bcl-2，阳性率与着色程度均高；在远离淋巴细胞浸润的滤泡上皮细胞Fas及FasL 、Bax呈低表达，Bcl-2呈高表达；浸润淋巴细胞上Fas及FasL 、Bax呈极低表达，Bcl-2呈高表达;雷公藤组：较少淋巴细胞及浆细胞浸润，浸润淋巴细胞附近的甲状腺滤泡上皮细胞的细胞膜及胞质内明显表达Fas及FasL、Bax,其阳性率与着色程度较低; Bcl-2阳性率及着色较高。中药组：少量淋巴细胞滤泡上皮细胞浸润未见浆细胞浸润，滤泡上皮细胞膜及胞浆低表达Fas及FasL、Bax，阳性率及着色较低，Bcl-2高表达，阳性率及着色较高（400×）。见图1～4。
3.2 各组大鼠血清抗体±s比较见表1。表1 各组大鼠血清抗体比较（略）
表1说明模型组与治疗组比较TPOAb有明显差异（P<0.01）；治疗组间比较有统计学差异（P<0.05）。说明两治疗组均可以明显降低TPOAb，但中药组优于雷公藤组。