β-榄香烯对人胃癌BAC823细胞凋亡及P38MAPK磷酸化的影响

【摘要】  目的探讨P38MAPK信号转导通路在β-榄香烯诱导人胃癌BAC823细胞凋亡过程中调控作用。方法人胃癌BAC823细胞体外传代培养，按空白对照组和药物处理组随机分组，其中药物处理组依药物浓度的不同再分为0.01，0.02，0.04，0.08 mg/ml，0.10及0.16 mg/ml处理组，作用时间为24h，采用流式细胞光度分析术(FCM)检测细胞凋亡率及细胞周期时相分布，同时进行细胞的形态学观察;采用免疫组化法检测P-P38MAPK的表达。结果β-榄香烯可阻滞BAC823细胞于S期并诱导细胞凋亡，但细胞凋亡率并不完全与药物浓度呈正相关。P38MAPK的活化水平随药物浓度的增加而增强。结论β-榄香烯可激活P38MAPK通路，而且此通路也很可能参与了β-榄香烯阻滞细胞周期诱导肿瘤细胞凋亡的过程。

【关键词】  β-榄香烯; 人胃癌BAC823细胞; 细胞凋亡; P38MAPK

　　MethodsHuman gastric cancer BAC823 cells were cultured in vitro .The cells were divided into two groups including blank control group and drug groups.In terms of concentration, drug groups were divided into 0.01，0.02，0.04，0.08,0.10,and 0.16 mg/ml groups.The effective time was 24h . Apoptotic rate and fraction of the cell cycle phase were measured with flow cytometry(FCM).At the same time,morphological and adhesive changes of the cells were observed under an inverted microscope. The level of P-P38MAPK was measured with immunocytochemical method.

　　Results1.The result of FCM examination and morphological observation showed that β-elemene could inhibit BAC823 cells at S phase and induce apoptosis.But between the rate of apoptosis and the drug concentration ,there was linear correlationship. 2. The result of SABC showed that the level of P-P38MAPK was enhanced while the drug concentration increased.

　　Conclusionβ-elemene can activate P38MAPK pathway and the pathway probably takes part in regulating the apoptotic process .

　　Key words：β-elemene; Human gastric cancer BAC823 cells; Apoptosis ; P38MAPK

　　β-榄香烯是从活血化淤中药温莪术挥发油中提取的一种抗癌有效成分，经药理学试验表明，其抗癌作用疗效确切、毒副作用小、抗瘤谱广,具有广阔的应用前景[1]。现已证实诱导肿瘤细胞凋亡是β-榄香烯抗癌作用机理的重要方面之一[2]。本实验通过检测β-榄香烯对胃癌BAC823细胞凋亡的影响及BAC823细胞在β-榄香烯作用下细胞信号转导因子P38MAPK的磷酸化即其活化水平，初步探讨P38MAPK信号通路在β-榄香烯诱导肿瘤细胞凋亡过程中的调控作用。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药物β-榄香烯，从温莪术挥发油中提取，由大连金港制药厂提供，经湖南中医药大学药学院药化实验室鉴定纯度为99.8%。

　　1.2 细胞株人胃癌BAC823细胞株，引自中南大学湘雅医学院细胞实验中心。

　　1.3 试剂 Hanks液(武汉博士得生物工程有限公司);0.25%胰蛋白酶(美国DIFCO公司);RPMI1640(美国GIBCO公司);小牛血清(杭州四季生物制品有限公司);4%多聚甲醛(武汉博士得生物工程有限公司);多聚赖氨酸粘片剂(北京中杉生物技术有限公司);PBS平衡液(武汉博士得生物工程有限公司);P-P38MAPK抗体(200μg/ml,北京中杉生物技术有限公司);SABC试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司);DAB显色试剂盒(武汉博士得生物工程有限公司)。

　　1.4 仪器净化工作台(SW-CJ-IF，苏州净化设备厂);CO2培养箱(CJ-1088型，长沙长锦应用技术研究所);生物倒置显微镜(XSB-1A，广西梧州光学仪器厂);高速冷冻离心机(TGL16M，长沙科威实业有限公司);流式细胞仪(EPICSXI，美国COULTER公司);图像分析软件(Optimas 6.5, 美国) 等。

　　2 方法

　　2.1 细胞培养在37℃，100%相对湿度，5%CO2，95%空气的培养箱中，用含10%小牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素，pH值为7.2的RPMI-1640完全培养液体外传代培养。

　　2.2 分组整个实验过程分批进行，每批细胞按所要检测的指标随机分为药物处理组和空白对照组，其中药物处理组设6个浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.08，0.10，0.16 mg/ml，作用时间为24 h。

　　2.3 指标检测

　　2.3.1 人胃癌BAC823细胞凋亡的形态学观察取对数生长期细胞，用RPMI1640培养液制备成浓度为5.0×104/ml的细胞悬液，然后平均分配至各细胞培养瓶中，并随机分为7组，预培养24 h;临用前，将β-榄香烯用RPMI1640培养液稀释，稀释终浓度分别为0.01，0.02，0.04，0.08，0.10，0.16 mg/ml;取出细胞培养瓶，弃去培养液，用Hanks液洗3次后，按照分组，分别加入等量不同浓度的β-榄香烯稀释液，其中一组为空白对照组即不含药物组;放入培养箱中继续培养24 h。24 h后将细胞培养瓶置于倒置显微镜下进行观察,比较不同浓度药物处理组及空白对照组细胞形态、大小及细胞群体生长情况的不同,照相并记录实验结果。

　　2.3.2 细胞凋亡率及细胞阻滞周期的检测采用流式细胞光度分析术(FCM)。1 000 r/min离心5 min收集以上各组处理后细胞，每个样本含细胞至少1.0×106;于各离心管中加入预冷0℃70%乙醇溶液，并用吸管吹打均匀，固定18 h以上;离心后去固定液，再加入PBS液重悬5 min,400目筛网过滤1次，500～1 000 r/min离心5 min后去PBS,用1 ml PI染液闭光染色30 min;上机检测。

　　2.3.3 人胃癌BAC823细胞P-P38MAPK的表达采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶技术(SABC技术)。