阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析
3 结果
3.1 RNA提取结果从阳春砂嫩叶中提取总RNA，电泳结果如图1所示，28S和18S rRNA条带清晰，无DNA污染，RNA浓度约为1μg·μl-1。
3.2 AvHMGR核心片段扩增及3’-RACE、5’-RACE结果如图2 所示，1st PCR和2nd PCR分别获得约650 bp的目的片段。1st PCR产物测序结果获得618 bp的序列，Blastn检索结果显示，该序列与其他植物来源的HMGR序列有较高相似性(75%～77%)。M.DL2000 DNA marker M. DL2000 DNA marker1，2. 叶片总RNA 1. 2nd PCR 2. 1st PCR图1 阳春砂叶片 图2 AvHMGR核心总RNA电泳图 片段的扩增
通过3’-RACE获得约750 bp的片段(图3A)，测序得到以polyA结尾的761 bp的序列，Blastn检索结果显示，该序列与其他植物来源的HMGR序列3’端有较高相似性(69%～78%)。
通过5’-RACE获得约1 200 bp的片段(图3B)，测序得到1 222 bp的序列，Blastn检索结果显示，该序列与其他植物来源的HMGR 5’端序列有较高相似性(74%～80%)。
3.3 AvHMGR全长cDNA的拼接及其编码区的克隆将克隆获得的5’端1 222 bp、核心片段618 bp与3’端 761 bp的序列进行拼接，获得了AvHMGR的cDNA全长，共2 023 bp，包含5’ 端92 bp的非编码区、1 713 bp的ORF和3’端218 bp的非编码区，最后以polyA结尾，编码571个氨基酸。
以引物AHO1和AHO2扩增获得编码区(图3C)，测序得到1 775 bp的插入序列。2个阳性克隆的测序结果验证了全长cDNA拼接序列的正确性。向GenBank提交阳春砂AvHMGR的cDNA全序列及其编码的氨基酸序列，获得序列登记号FJ455511及对应的蛋白序列登记号ACR02667。
3.4 AvHMGR编码蛋白的分析 根据软件分析的结果，AvHMGR编码蛋白的分子量为60.5 kDa，等电点为7.405。亚细胞定位预测结果显示，AvHMGR蛋白的N-端没有信号肽或线粒体、叶绿体靶向转运肽。跨膜结构域预测结果显示，在其N-端有两个跨膜结构域(图5)，第一个位于第36位异亮氨酸(I)和第55位甲硫氨酸(M)之间，第二个位于第68位亮氨酸(L)到第90位亮氨酸(L)之间，两个跨膜结构域之间的肽链位于膜内，之外的肽链主要位于膜外。AvHMGR具有NADPH结合位点“DAMGMNM”和“GTVGGGT”，也具有和底物HMG-CoA的结合位点“ELPIGYVQLP”和“TTEGCLVA”(见图5)。
3.5 AvHMGR与其他植物HMGR蛋白的同源性及系统进化关系Blastp结果表明，AvHMGR蛋白与来源于其他植物的HMGR蛋白有广泛相似性。表3列出了AvHMGR与文献报道的其他10个植物HMGR蛋白[10～19]的序列比对结果，相似性达到77%～89%。M1. DL2000 DNA markerM2. 250 bp DNA marker1. 3’端 2. 5’端 3.编码区图3 AvHMGR 3’端、5’端以及编码区的扩增表3 AvHMGR与其他10个植物HMGR蛋白相似性比较
AvHMGR与其他10个植物HMGR的系统进化关系分析结果如图4所示，11种HMGR的分子进化关系与其来源植物的亲缘关系基本一致，AvHMGR与同为单子叶植物的水稻OsHMGR聚为一枝。图4 AvHMGR与其他10个植物HMGR蛋白的系统进化树对AvHMGR与水稻、杜仲和大戟的HMGR多重比对结果(图5)显示，它们的相似保守区域主要集中在N-端第30至第100位氨基酸区域和第155位氨基酸之后的C-端区域。推测N-端的保守区域可能与HMGR蛋白的跨膜结构域相关，而C-端保守区域与HMGR蛋白的催化功能相关。
3.6 AvHMGR功能预测用AvHMGR的序列进行CDD搜索，结果显示AvHMGR蛋白归属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶超级家族(cl00205: HMG-CoA_reductase Super-family)中的HMGRⅠ类酶(cd00643：Hydroxymethylglutaryl-coenzyme A reductase, class I enzyme)，为同源四聚体。
3.7 AvDXR1半定量RT-PCR结果如图6所示，根据半定量RT-PCR的结果，AvHMGR在茎、根、果皮和种子团中的表达量高于在叶片中的表达量。黑色、深灰色和灰色描影分别示序列相似性为100%、≥75%和≥50%;AvHMGR、OsHMGR、EuHMGR与EpHMGR分别来源于阳春砂、水稻、杜仲和大戟;上划线区域示两个跨膜结构域，带星号标注的4个序列分别为NADPH结合位点“DAMGMNM”和“GTVGGGT”， 及HMG-CoA结合位点“E(L/M)P(I/V)G(Y/F)(V/L)Q(L/I)P”和“TTEGCLVA”图5 AvHMGR与OsHMGR、EuHMGR、EpHMGR的多重比对1. 叶 2. 茎 3. 根 4. 果皮 5. 种子团图6 AvHMGR在阳春砂不同组织中的半定量RT-PCR结果
4 讨论
本研究应用简并引物RT-PCR与RACE结合的方法，首次从阳春砂叶片中克隆了AvHMGR基因。AvHMGR基因cDNA全长2 023 bp，编码蛋白包含571个氨基酸，与其他植物来源的HMGR有较高相似性。对AvHMGR蛋白序列的CDD检索结果显示，AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原异构酶(HMGR)家族，这一类酶在萜类生物合成途径中催化甲羟戊酸的合成，在植物中是细胞质萜类化合物代谢中的重要调控点。自然界存在两类HMGR，类型Ⅰ主要存在于真核生物，在其N-端有跨膜结构域，类型Ⅱ主要存在于原核生物，不具有跨膜结构，检索结果显示AvHMGR蛋白属于HMGRⅠ类酶。AvHMGR也具有植物HMGR典型的NADPH结合位点(NADPH为HMGR催化的还原反应提供还原力)，也具有底物HMG-CoA的结合位点，其中“TTEGCLVA”中的谷氨酸Glu在HMGR催化中具有重要作用[22]。HMGR是一类定位在内质网膜上的蛋白[8]，N-端具有两个跨膜结构域是目前克隆获得的植物HMGR编码蛋白的共有特征[22]。阳春砂AvHMGR蛋白的N-端也具有两个跨膜结构域，推测这与其定位于细胞质的内质网膜上，行使其催化功能相关。这与已知的MVA途径发生在细胞质中是相符的。通过以上生物信息学的分析，初步证明了克隆获得的AvHMGR是阳春砂萜类生物合成途径关键酶HMGR的编码基因。
EuHMGR在杜仲叶和茎部的表达量高于根部的表达量[16]，EpHMGR在大戟的根、茎、叶中均有表达，在根部的表达量最高[13]。本研究对AvHMGR在阳春砂不同组织中的表达分析显示，AvHMGR也在阳春砂的不同组织中广泛表达，在根、茎和果皮、种子团中的表达均高于在叶片中的表达。由于果实是阳春砂的主要药用部位，AvHMGR在果实中的表达对于阳春砂萜类生物合成的原位调控具有重要意义。
本研究克隆获得了阳春砂AvHMGR基因，分析了该基因在不同组织中的表达，为进一步鉴定该基因的功能打下基础，为将其应用于萜类药效成分生物合成的基因工程调控提供依据。
致谢：广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心刘艳、黄琼林、宁鑫、吴睿等研究生参与了植物培养、果实取样的工作，广东阳春市砂仁试验示范场苏景场长提供了阳春砂种苗，特此致谢。
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