阳春砂3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的克隆及分析

             作者：杨锦芬，何国振，阿迪卡利，徐晖，何瑞，詹若挺，陈蔚文

【摘要】  目的克隆阳春砂萜类生物合成途径上游关键酶——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC：1.1.1.34)的编码基因;分析基因的功能及其在阳春砂不同组织中的表达。方法用基于RT-PCR的方法从阳春砂叶片中获得编码HMGR的cDNA全长序列，克隆基因编码区;用生物信息学的方法对其编码蛋白进行相似性检索和功能分析;用半定量RT-PCR法比较基因在阳春砂不同组织中的表达差异。结果获得了全长2 023 bp的编码阳春砂HMGR的cDNA序列，命名为AvHMGR(GenBank登记号：FJ455511)。AvHMGR编码的蛋白与其他植物来源的HMGR有很高相似性，含有NADPH结合基序和底物HMG-CoA结合基序，N-端有两个跨膜结构域。保守功能结构域的分析结果表明AvHMGR属于3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶家族。AvHMGR在包括茎、根、果皮和种子团的广泛组织中表达，且在这些组织中的表达量均高于在叶片中的表达。结论从阳春砂中克隆了AvHMGR基因，为进一步鉴定基因功能、探明阳春砂萜类生物合成的基因调控机制打下基础。

【关键词】  阳春砂; 萜类化合物; 3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR); 基因克隆; 基因表达

　　Abstract：ObjectiveTo clone the gene encoding 3-hydroding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGR,EC:1.1.1.34),the key enzyme of biosynthetic pathways of terpenoids,from Amomum villosum and analyze its function and expression in different tissues of Amomum villosum.

　　MethodsMethod based on RT-PCR by using degenerate primers and rapid amplification of cDNA ends(RACE) was used to clone gene.Bioinformatic analysis was used to identify the gene.Semi-quantitative RT-PCR was carried out to analyze the expressional difference of the gene in different tissues.

　　ResultsA cDNA encoding HMGR(designated as AvHMGR,GenBank accession number FJ455511) was isolated from leaves of Amomum villosum for the first time.The full-length cDNA of AvHMGR was 2023 bp containing an open reading frame(ORF) of 1713 bp encoding 571 amimo acids.Bioinformatic analysis revealed that the deduced protein AvHMGR had extensive sequence similarities to other plant HMGRs and was more homologous with HMGRs from monocotyledonous plants.AvHMGRs had two NADPH binding motifs and two HMG-CoA binding motif.Two transmembrane regions were found in its N-terminal region.Result of CDD search indicated that it belonged to the HMGR super-family.AvHMGR expressed in leaves,stems,roots,pericarps and seeds of Amomum villosum and lower transcription level was observed in leaves than that of other tissues.

　　ConclusionAvHMGR encodes HMGR in Amomum villosum.

　　Key words：Amomum villosrm; Terpenoids; 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase(HMGR); Gene colning; gene expression

　　砂仁是我国著名的“四大南药”之一，具有化湿开胃、温脾止泻、理气安胎等功效。阳春砂Amomum villosum Lour.是砂仁药材的主要来源植物[1]。砂仁化湿行气的主要药效物质为挥发油，其主要成分为萜类化合物[1,2]。近年来，萜类化合物代谢的研究成为目前药用植物次生代谢研究领域的热点之一。随着分子生物学的发展，萜类化合物生物合成途径相关酶类的编码基因也不断被克隆和研究[3～5]。

　　甲羟戊酸途径(mevalonate pathway，简称MVA途径)和丙酮酸/磷酸甘油醛途径(pyruvate/glyceraldehyde-3-phosphate pathway，简称DXP途径)是植物萜类化合物生物合成的两条途径，MVA途径在细胞质中进行，而DXP途径发生在质体中[3]。两条途径并不完全独立，而是有着相互关联，一条途径被抑制后，能被另一条途径部分补偿[6，7]。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase, HMGR)(EC：1.1.1.34)催化3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)转化为甲羟戊酸的不可逆反应是MVA途径的第1个限速步骤，是萜类生物合成上游途径中的重要调控点[8]。HMGR基因已经从长春花Catharanthus roseus[9]，水稻Oryza sativa[10]，橡胶树Hevea brasiliensis[11]，桑树Morus alba[12]，大戟Euphorbia Pekinensis[13]，马铃薯Solanum tuberosum[14]，喜树Camptotheca acuminata[15]，杜仲Eucommia ulmoides[16]，辣椒Capsicum annuum[17]，银杏Ginkgo biloba[18]，红豆杉Taxus media[19]等多种植物包括药用植物中克隆。

　　本研究用简并引物RT-PCR结合RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends)的方法，从阳春砂叶片中克隆了编码HMGR的基因，通过生物信息学分析初步鉴定了基因的功能，用半定量RT-PCR法分析了基因在不同组织中的表达差异，为保护阳春砂的基因资源，进一步探明阳春砂药效物质萜类成分生物合成的调控机制打下基础。

　　1 材料

　　1.1 植物材料用于基因克隆的阳春砂引种自广东阳春市砂仁试验示范场，栽种于广州中医药大学大学城药圃。

　　用于基因表达分析的阳春砂幼苗培养方法：取阳春砂种子用细砂搓去假种皮，浸种24 h后播种于盛有营养土与粗砂比例为3∶1的基质的育苗盆中室温光照培养，待幼苗长出2～4片真叶后间苗，每盆(直径12 cm)留取生长一致的苗2～3株，待苗龄约6个月(长出7～9片真叶)时取第1位完全展开叶、茎和根，用于基因表达分析。阳春砂成熟果实取自阳春春湾，液氮速冻后-70℃保存备用。

　　1.2 试剂植物RNA提取试剂盒(北京普利莱基因技术公司);PrimeScript RT-PCR Kit、1st Strand cDNA Synthesis Kit、Ex Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶、克隆载体pMD18-T(宝生物工程大连有限公司);柱式植物RNAout试剂盒(北京天泽基因公司);克隆载体pGEM-T(美国，Promega);SMART RACE Kit(美国，Clontech);大肠杆菌E.coli菌株DH5α(本实验室保存);Taq DNA聚合酶、DNA回收试剂盒(北京赛百盛生物工程公司);引物由上海生工生物工程公司合成;测序由上海生工生物工程公司和上海英潍捷基(invitrogen)公司完成。

　　2 方法

　　2.1 目的基因核心片段的扩增

　　2.1.1 简并引物设计 从GenBank上检索来源于单子叶植物的HMGR序列，获得水稻、玉米、薯蓣的HMGR序列(登记号分别为NM-001070076，Y09238，DQ017377)。用Omiga2.0软件对上述序列进行比对，根据其高度同源区域设计2对用于嵌套PCR的简并引物AH1，AH3和AH2，AH4。引物序列见表1。

　　2.1.2 总RNA的提取取0.1 g新鲜叶片，用植物RNA提取试剂盒，参照说明书的方法提取总RNA。用1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA的完整性，测定OD260与OD280，确定总RNA的浓度与纯度。

　　2.1.3 RT-PCR取总RNA 2 μg，用PrimeScript RT-PCR Kit，参照说明书的方法，以Oligo(dT)为引物进行反转录。下一步以反转录产物为模板，以AH1、AH3为引物进行PCR。反应体系(20 μl)：Ex Taq酶(5 U·μl-1) 0.1 μl，10×PCR buffer 2 μl，dNTP(10 mM) 1.5 μl，上游引物(10 μM) 0.75 μl，下游引物(10 μM) 0.75 μl，反转录产物1.5 μl，ddH2O 13 μl。PCR反应程序：94℃ 3 min;94℃ 0.5 min，54℃ 0.5 min，72℃ 1 min，37个循环;72℃ 5 min。以引物AH2、AH4进行2nd PCR，模板取1st PCR产物1 μl，退火温度为53℃，其余与1st PCR相同。PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳检测，确认特异条带后，按比例扩大体积至100 μl进行PCR。用DNA回收试剂盒，参照说明书的方法回收PCR产物，用相应的简并引物进行测序。

　　2.1.4 核心片段的确认登陆NCBI/BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，将测序结果进行Blastn(nucleotide blast)检索，检验所获片段与已知的其他植物HMGR序列的相似性。

　　2.2 目的基因3’端及5’端的克隆

　　2.2.1 RACE引物的设计用于3’-RACE的反转录引物R3以及用于PCR的下游引物R3P1见表1。根据“2.1.4”项下获得的核心片段序列和RACE试剂盒的引物设计要求，设计相应的3’-RACE上游引物AH31和5’-RACE下游引物AH51、AH52。见表1。

　　2.2.2 3'-RACE以总RNA为模板、R3为引物进行反转录。再以R3P1、AH31为引物，参照前“2.1.3”项下的PCR反应体系及程序，调整相应的退火温度和延伸时间进行PCR。回收PCR目的片段，连接至pMD18-T载体，热击法[20]转化E.coli DH5α，以经PCR检测的阳性菌落用载体通用引物测序。

　　2.2.3 5'-RACE用SMART RACE Kit，参照说明书的方法进行反转录，再以试剂盒中的UPM和NUP为上游引物，分别与目的基因的5’-RACE特异引物AH51、AH52配对，以LA Taq酶进行PCR。回收PCR目的片段，克隆至pGEM-T载体，用载体通用引物测序。

　　2.3 cDNA全序列的拼接及编码区的克隆用Omiga2.0软件，对3’-RACE和5’-RACE的测序结果进行分析，去除载体序列，利用NCBI的“Blast 2 Sequences”功能，将3’和5’端序列分别与“2.1.4”项下获得的核心序列进行比对和拼接，获得cDNA全长序列，再用Omiga2.0软件分析其开放阅读框架(ORF)，翻译成氨基酸序列。用NCBI的Blastp程序对所获的氨基酸序列进行同源检索，初步确认获得的翻译蛋白是否为HMGR的同源蛋白及其完整性。根据cDNA全序列中编码区的两侧序列设计引物AHO1和AHO2(表1)，以“2.1.3”项下获得的反转录产物为模板，扩增编码区全长。将回收片段克隆至pGEM-T载体，选2个以上阳性克隆进行测序和序列分析。表1 阳春砂AvHMGR克隆所用引物

　　2.4 基因编码蛋白分析及序列提交 用DNAstar5.0软件分析目的基因编码蛋白的分子量、等电点等理化性质。登陆http://hc.ims.u-tokyo.ac.jp/iPSORT/，采用iPSORT运算法则对蛋白进行亚细胞定位预测。登陆http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/，对蛋白进行跨膜结构域在线预测。利用NCBI的Blastp程序对氨基酸序列进行同源检索。登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml，利用保守功能域数据库(conserved domain database，CDD)进行蛋白保守功能域的在线预测[21]。用DNAMAN5.0软件进行氨基酸序列的多重比对以及系统发育树的绘制。登陆http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BankIt/，向GenBank提交AvHMGR的cDNA序列及其编码的氨基酸序列。

　　2.5 基因表达分析

　　2.5.1 RNA提取叶片、根和茎的总RNA提取按照“2.1.2”的方法进行。用柱式植物RNAout，参照说明书的方法进行果皮和

　　种子团总RNA的提取。

　　2.5.2 反转录用1st Strand cDNA Synthesis Kit，参照说明书的方法进行。

　　2.5.3 半定量PCR根据芭蕉和三七的18S rRNA基因序列(EF376005和D85171)的比对结果，设计引物18SF、18SR(表2)，扩增半定量RT-PCR体系的内参照18S rRNA。设计引物AHR2、AHR3(表2)，扩增目的基因片段(约640 bp)。以反转录产物为模板进行半定量PCR。反应体系(20 μl)：10×PCR buffer 2 μl，Dye(PCR染料)2 μl，dNTP(10 mM)1.5 μl，上游引物(10 μM)0.5 μl，下游引物(10 μM)0.5 μl，Taq DNA聚合酶(5U·μl-1)0.2μl，根据18S rRNA的扩增结果调整相应模板的用量，灭菌超纯水补足体积。PCR反应程序：94℃ 2 min;94℃ 0.5 min，55℃ 0.5 min，72℃ 1 min，29个循环(18S rRNA)或30个循环(AvHMGR)。每个反应取5 μl PCR产物以1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测产物亮度。每个反应重复3次以上。表2 AvHMGR半定量RT-PCR所用引物