更年期抑郁症与海马、皮质5-HTR1AmRNA相关性的实验研究

              作者：刘艳玲1，宋卓敏，丁雨

【摘要】  目的从基因水平探讨更年期抑郁症与5-HT1A受体亚型转录水平的相关性及中医药干预作用。方法对雌性成年大鼠采用去势+孤养+改良的慢性不可预见应激建立更年期抑郁症模型;将去势大鼠随机分为更年期组、模型组、西药组(百优解联用雌激素)、中药组(一解合方)，并以假手术组为对照。采用RT-PCR法测定海马、皮质神经元中5-HTR1A mRNA转录水平，应用GIS-2010凝胶图像分析系统照相、读取灰度值。比较分析各组之间的差异。结果模型组大鼠海马、皮质5-HTR1A mRNA转录水平低于假手术组，有显著性差异(P<0.01);中药组大鼠海马、皮质5-HTR1A mRNA转录水平显著高于模型组、西药组(P<0.01)。结论更年期抑郁症在基因水平的发生机理可能是由于5-HTR1AmRNA转录功能受到破坏，中药一解合方可通过影响海马、皮质突触后5-HTR1A mRNA转录水平而发挥治疗作用。5-HTR1A mRNA的转录水平可作为药物治疗新靶点，值得进一步研究。

【关键词】  更年期抑郁症; 5-HTR1A mRNA; 中医药; 一解合方

　近年来，随着分子生物学的不断发展，5-羟色胺受体在抑郁症的发病学说中引起很大重视。突触间隙5-HT作为神经递质必须与其相应的受体结合方可进行信息传递。前期研究[1]显示5-HTR1A与更年期抑郁症发病密切相关，本实验拟从基因水平进一步探讨5-HTR1A mRNA在更年期抑郁症发病中的病理机制，以期寻找药物作用新靶点，为临床治疗提供新思路。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物与分组雌性Wistar清洁级大鼠50只，体质量(210±20)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。

　　采用Open-Field法进行行为学测定后，将水平运动和垂直运动总得分≤30分或≥120 分、体质量≥230 g或≤190 g的大鼠，予以剔除，共选取 43 只评分及体质量相近的大鼠，按随机数字表法分为5组：①假手术组;②更年期组(去势);③更年期抑郁症模型组(去势+应激);④西药组(去势+应激+百优解联用雌激素);⑤中药组(去势+应激+一解合方)。其中假手术组和更年期组各8只，模型组、中药组、西药组各9只。

　　1.2 药品中药一解合方浸膏(药物组成：熟地30 g，北沙参20 g，麦门冬20 g，厚朴10 g，陈皮10 g，半夏15 g，茯神15 g，苏梗10 g，石菖蒲6 g，郁金10 g，砂仁6 g等)，由天津中医药大学中医药研究研究院制剂室提供。西药：百优解(Eli Lilly and Company Limited，批号：A140885)，用蒸馏水配成0.4 mg/ml混悬液，4℃保存，使用时充分摇匀。苯甲酸雌二醇注射液(天津金耀氨基酸生产有限公司，批号：0505111)。

　　1.3 仪器及试剂紫外分光光度计(BioPhotometer) (德国Eppendorf公司)，台式高速冷冻离心机(3K18)(美国Sigma公司)，PCR扩增仪(TH-48a)(杭州大和热磁有限公司)，多功能电泳仪(北京六一仪器厂)，全自动凝胶图像分析系统(上海天能科技公司)。

　　ImProm-Ⅱ反转录酶、dNTP、随机引物pd(N)6购自美国Promega公司;异硫氰酸胍、DEPC、和β-巯基乙醇等购自美国Simga公司;Taq DNA聚合酶、Tris碱、水饱和酚、超纯水和DNA分子量标准Marker等购自北京鼎国生物技术有限公司;其它生化试剂均为国产分析纯。

　　2 方法

　　2.1 造模方法各组大鼠常规喂养1周后，术前禁食24 h，第2天进行手术。①模型、中药、西药和更年期4组大鼠行卵巢摘除术，10%水合氯醛(300 mg/kg体质量)腹腔注射麻醉，背位固定，于下腹部正中切开，逐层进入腹腔，结扎并剪去其双侧卵巢。术后1周阴道涂片，连续5 d阴道监测未见动情周期证明去势成功。②假手术组大鼠模型 手术方法同卵巢摘除术类似，但不切除卵巢，仅结扎、并摘取卵巢附近少许脂肪组织。③对去势成功后的模型、中药、西药3组大鼠进行慢性不可预见性应激(参考文献[2]并加以改良)。将大鼠每笼1只饲养，并给予21d各种不同的应激，包括电击足底(强度5 mA，每隔20s刺激1次，持续30 min)，冰水游泳(8℃，5 min)，热应激(45℃，5 min)，摇晃(1次/s，15 min)，夹尾(1 min)，禁水(24 h)，禁食(48 h)和昼夜颠倒等刺激，上述8种刺激每天随机选取一种，每项刺激至少进行2次，同种刺激不连续进行。

　　2.2 给药方法于应激开始同步给药，采用灌胃方式，连续21 d。假手术组、更年期组和模型组的大鼠均给予蒸馏水，剂量为10 mg/(kg·d);中药组大鼠给予一解合方浸膏，其用药量为8 g[相当于生药16 g/(kg·d)];西药组大鼠给予百优解混悬液，并肌注苯甲酸雌二醇，隔日1次。其百优解混悬液用药量为4 mg/(kg·d)，苯甲酸雌二醇，用药剂量每次为0.2 mg·kg。中西药用药剂量均根据人的日用药量，按大鼠体表面积比率换算成等效剂量。

　　2.3 指标检测及方法测定海马和皮质神经元中5-羟色胺受体亚型：5-HTR1A mRNA的转录水平。采用RT-PCR法进行检测，具体操作如下。

　　2.3.1 检测基因的引物设计与合成按照引物设计原则及所需实验条件，我们根据Genbank核酸数据库中的大鼠5-羟色胺1A受体(5-HTR1a)和看家基因G3PDH基因序列设计引物。引物序列见表1。全部引物由上海生物工程有限公司合成,经 PAGE纯化。表1 引物序列、位置和扩增片段长度

　　2.3.2 RNA的提取(参照Promega的RNAgents ② 总RNA提取试剂盒)①取约0.05 g组织放入预冷的含0.5 ml RNA裂解液的匀浆器中，加入3.5 μl β-巯基乙醇，匀浆至透清。②将匀浆好的液体转入离心管中，依次加入50 μl的2M NaAC(pH4.0)， 0.5 ml水饱和酚和100 μl氯仿/异戊醇(49∶1)，剧烈振荡充分混匀，冰浴15 min，每隔2～3 min混匀一次。③4℃ 14 000 r/min离心15 min，小心吸取上清。注意不要吸出界面的蛋白层。④加入等体积酚/氯仿混合液，混匀，冰浴15 min。⑤4℃ 14 000 r/min离心15 min，小心吸取上清。⑥上清加入等体积异丙醇，-20℃沉淀1 h以上。⑦4℃ 14 000 r/min离心20 min，弃上清，预冷75%乙醇漂洗，室温干燥。⑧溶于50 μl DEPC水中。⑨取2 μl电泳检测RNA完整性。紫外分光光度计检测RNA浓度。

　　2.3.3 逆转录反应每个反应取2 μg总RNA、随机引物：pd(N)6 2 μl和DEPC水，合计11.6 μl混合，70℃热变性10 min，迅速冰浴冷却3 min。其它试剂按下列体系(见表2)加入后混匀，37℃ 90 min。表2 反应体系

　　2.3.4 PCR反应条件优化及PCR扩增反体系结果见表3～4。表3 最佳PCR反应条件表4 PCR扩增体系表

　　2.3.5 凝胶电泳分析取PCR产物5 μl，2%琼脂糖凝胶上电泳，溴化乙锭(EB)染色，应用GIS-2010凝胶图像分析系统照相、读取灰度值并进行分析。

　　2.4 统计学处理应用spss11.5软件包进行统计学处理。全部实验数据用±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析。