三七总皂苷对实验性糖尿病性心肌病大鼠心脏谷胱甘肽转移酶基因表达的影响

来源:岁月联盟 作者:阎英杰,魏红,杨献英 时间:2015-05-19

【摘要】  目的探讨三七总皂苷对实验性糖尿病性心肌病大鼠心脏谷胱甘肽转移酶(GST)基因表达的影响。方法将50只造模成功的雄性SD大鼠随机分为治疗组30只和空白对照组10只,达美康对照组10只。治疗4周后提取各组心肌组织总RNA通过RT-PCR,以β-actin为内参照对GST基因的表达水平进行检测。结果不同剂量三七总皂苷组GST基因表达上调,与对照组相比有显著性差异(P<0.05)。结论三七总皂苷能够诱导GST基因表达,催化谷胱甘肽与亲电子物质发生结合反应,改善心肌细胞能量代谢,减轻心肌损害。

【关键词】  三七总皂苷; 糖尿病性心肌病大鼠; 谷胱甘肽转移酶类; 基因表达

 糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DC)自1974年由Hamby等首次提出以来,病因研究已深入到分子遗传、基因水平。对其发病机制已从代谢紊乱、收缩机制异常、微循环障碍、自主神经病变等多角度进行了深入研究。三七总皂苷(PNS)是中药三七的主要有效成分, 是防治心血管疾病的一种有效药物。为了深入探讨三七总皂苷对糖尿病性心肌病大鼠心脏超微结构的影响及基因分子水平上的作用机制,本实验进行了该方面的探讨。

  1 材料与仪器

  1.1 主要试剂和设备链脲佐菌素为美国Sigma公司产品,RNA提取试剂Trizol Reagent购自华美生物工程公司,为Invitrogen公司产品;逆转录酶(AMV-RT ),核糖核酸酶抑制剂(RNasin),dNTP,Taq DNA聚合酶(Taq DNA polymerase),随机引物(Random primers),琼脂糖(agarose)均购自美国Promega 公司。德国产Leica 800型冰冻切片机;美国产Tracor Northern 8502型图象分析仪;日本产日立H-600透射电镜。

  1.2 药物三七总皂苷片,由浙江维康药业有限公司生产。达美康( Gliclazide),法国施维雅公司产品。

  2 方法

  2.1 动物分组及处理选取52只雄性Sprague Dawley大鼠,给予腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ),连续注射10周,5周后血糖浓度持续大于16.6 mmol/L,表明已建立糖尿病模型。10周后,将2只糖尿病大鼠处死,取部分心肌组织做电镜检查,发现线粒体变性,肌纤维收缩带形成,表明已建立糖尿病性心肌病动物模型[1]。将50只造模成功的雄性SD大鼠随机分为治疗组30只和空白对照组10只,达美康对照组10只。治疗组分为PNS低、中、高剂量组各10只,分别给予腹腔注射不同剂量(PNS 50,100,150 mg·kg-1·d-1),空白对照组给予腹腔注射同等量的蒸馏水,达美康对照组给予腹腔注射达美康悬浮液20 mg/kg体重。经处理后作病理切片,分别观察不同剂量的三七总皂苷和对照组空腹血糖(FBG),在光镜下和电镜下观察大鼠心脏超微结构的变化,包括心肌、心肌间质、心肌内中小血管的变化,电镜下心肌细胞超微结构、心脏微血管的变化。

  2.2 心肌组织总RNA的提取 治疗4周后将大鼠处死,取心肌组织约100 mg,用Trizol试剂抽提组织总RNA,紫外分光光度计测A260及A280,要求A260/ A280比值介于1.8~2.0之间,根据A260计算总RNA含量,1%琼脂糖电泳观察总RNA的质量。-20 ℃保存备用。

  2.3 RT-PCR[2]反转录体系为总RNA 2 μg,随机引物 1 μl,70℃ 5 min,立即冰上冷却,加入10 mmol/L dNTP 1.25 μl。5×buffer 5 μl,M-MLV逆转录酶2 μl,加无Rnase水至总体积25 ml,混匀,37℃ 60 min,然后70 ℃ 5 min,-20℃保存备用 GST引物,上游:5’-AGAAGACCACAGCACCAGCA-3’,下游:5’-AGAGAGAACCAGGAGCCACA-3’,片断长度790 bp; β-actin引物,上游:5’-GTGGGCCGCTCTAGGCACCAA-3’,下游:5’-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3’,片断长度540 bp;PCR在94℃ 45 s,58℃ 30 s,72 ℃1 min 45 s条件下合成,循环35次,产物于1.5%琼脂电泳后紫外灯下摄影,同时测目的带灰度值,与β-actin比较进行半定量。

  2.4 统计学处理所有数据用SPSS11.5软件处理。实验数据以±s表示,组间t检验、F检验比较。

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