芒果苷磺酸钠抗白血病的实验研究

                作者：袁叶飞，邓家刚，胡祥宇，欧贤红

【摘要】  目的观察芒果苷磺酸钠体内外抗白血病的作用。方法采用MTT法,观察不同浓度芒果苷磺酸钠对K562细胞生长的影响;建立小鼠K562白血病模型，考察芒果苷磺酸钠对K562白血病小鼠的生命延长率。结果不同浓度的芒果苷磺酸钠在不同时间对K562细胞均有抑制作用, 并随浓度升高和作用时间延长而抑制作用增强,但其抑制作用稍弱于同浓度的芒果苷;芒果苷磺酸钠能明显提高K562白血病小鼠的生命延长率。 结论芒果苷磺酸钠有较好的体内外抗白血病作用。

【关键词】  芒果苷磺酸钠; K562细胞; 白血病

　　Abstract：ObjectiveTo observe the antileukemia effect of mangiferin sulfonate sodium in vitro and vivo.MethodsThe effect of different concentrations of mangiferin sulfonate sodium on the proliferation of K562 leukemia cells was examined by MTT assay;and the mouse survival rate was observed by establishing K562 antileukemia model in mice.ResultsDifferent concentrations of mangiferin sulfonate sodium inhibited the K562 cell proliferation in different time, the inhibition effect was dependent on time and concentration,but its inhibition effect was slightly weaker than the same concentration mangiferin. Mangiferin sulfonate sodium could obviously prolong mouse survival time.ConclusionMangiferin sulfonate sodium has good antilelkemia effect in vitro and vivo.

　　Key words： Mangiferin sulfonate sodium; K562 cell; Leukemia

　　芒果苷,又名芒果素、知母宁,广泛存在于百合科植物知母,漆树科芒果树、扁桃树的叶、果实和树皮,龙胆科植物东北龙胆、川西獐芽菜,水龙骨科植物光石韦等植物中。芒果苷为芒果叶的主要成分,含量达1.92%[1];芒果苷也为川西獐牙菜的主要成分，它在川西獐牙菜中的含量达0.98%[2]。芒果苷具有多方面的生理活性和药理作用，有止咳、祛痰、平喘及抗炎、免疫、保肝利胆、抗脂质过氧化、抗病毒、抗菌、抗糖尿病和抗肿瘤等作用[3]。

　　芒果苷还具有抗白血病作用，芒果苷可抑制慢性髓系白血病K562细胞的增殖，并可能通过抑制bcr/abl融合基因的表达诱导K562细胞凋亡[4]。

　　但芒果苷是一种四羟基的酮碳糖苷(图1),水溶性极差,难以制成合适浓度的稳定药液,影响其疗效及其应用。增加难溶性药物的溶解度以满足治疗需要,是中药制剂的重要问题。前期我们通过结构修饰在芒果苷的4-位引入了-SO3Na(磺酸钠基),制备得到芒果苷磺酸钠盐(如图2),改善了芒果苷的水溶性。本实验通过噻唑兰(MTT)方法研究其对白血病K562细胞株的增殖抑制作用,并通过体内试验验证其抗白血病的作用，为其开发为抗白血病新药提供理论依据。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药物 Eagles MEM干粉和G148，美国Gibco公司产品;MTT及DMSO，美国Sigama公司产品;L-谷氨酰胺，北科化学试剂公司进口分装;胎牛血清，美国Hyclone Lab公司产品;卡那霉素，Sigma分装;MEM 培养液含10%胎牛血清、0.03%谷氨酰胺，G418 380 g/ml，卡那霉素50 U/ml，pH 7.2。细胞消化液含0.25%胰蛋白酶，用D-Hangs配制;环磷酰胺(CTX)，江苏恒瑞医药股份有限公司产品，临用时以生理盐水配成2 mg/ml的溶液;芒果苷磺酸钠(自制，纯度95%)，以生理盐水配制成10，5.0，2.5 mg/ml 3种浓度的溶液。

　　图1 芒果苷的结构 图2 芒果苷磺酸钠的结构

　　1.2 细胞株 人慢粒白血病细胞株K562购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库, 并由泸州医学院毒理研究所细胞室传代保存。

　　1.3 仪器 CO2培养箱(Thermo Forma)，美国产，型号381;倒置显微镜(Olympus)，日本产，型号CK40;酶标仪(Biocel1)，奥地利产，型号Sunrise。

　　1.4 动物健康昆明种小鼠,雌雄各半，体质量(20±2) g，由泸州医学院实验动物科提供，合格证号：川实动证第07216号。

　　2 方法

　　2.1 细胞生长抑制试验取对数生长期的K562细胞, 调整细胞浓度为5×104/ml, 接种于96孔培养板, 每孔加20 μl细胞液。药物(芒果苷磺酸钠和芒果苷)用培养液配成1 mg/ml,实验组均分别以不同终浓度(31.3，62.5，125，250，500 μg/ml) 芒果苷磺酸钠和芒果苷处理, 另设对照组(不加药)和空白组(只加培养液), 每组设4个复孔, 培养24，48，72和96 h后, 加入MTT 10 μl, 4 h后, 离心弃上清液, 每孔加入DMSO150 μl，轻轻振荡, 待结晶完全溶解, 10 min后,在酶标仪上以波长为550 nm，参比波长为450 nm测定OD值, 计算平均抑制率,并以改良寇式法计算半数抑制浓度IC50[5]，实验重复3次(n=12)。按如下公式计算抑制率和IC50：抑制率(%)=(对照组平均OD值- 实验组平均OD值)/对照组平均OD值;IC50=lg-1[Xm-i (∑p-0.5)]，式中Xm：设计的最大浓度的对数值;i：相邻两组浓度对数值之差;∑p：各组生长抑制率之和;0.5：经验常数。

　　2.2 芒果苷磺酸钠对荷瘤小鼠生存期的影响无菌条件下抽取接种7 d、生长良好的K562白血病小鼠腹水，用灭菌生理盐水(1∶3)稀释，按0.2 ml/只经腹腔注射(约5～6×106个瘤细胞)腹水(活细胞率>95%)，制备腹水型荷瘤小鼠模型。接种后24 h随机分成5组,每组15只，ip给药,0.4 ml/只，共计10 d。①模型组，生理盐水;②芒果苷磺酸钠3个剂量组分别为200，100，50 mg/kg;③阳性对照组，环磷酰胺20 mg/kg。连续30 d记录各鼠死亡时间，计算各组小鼠平均生存天数、生命延长率。生命延长率(%)=(治疗组平均生存天数一模型组平均生存天数)/模型组平均生存天数×100%。

　　2.3 统计学方法检验各组测定结果以 ±s表示，组间均数比较用t检验。