浅蓝菌素脂质体的制备及其对肿瘤细胞体外增殖影响的研究
2 结果
2.1 浅蓝菌素标准曲线
浅蓝菌素的保留时间为12.7 min；吸收峰面积（A）与药物浓度(c) 之间的直线回归方程为A=3.5784c+0.1592(R2=0.999 7, n=5)，表明药物浓度在0.5×10-6～1000×10-6 mol·L-1范围内线性关系良好；确定最低检测限为0.4 ng。
2.2 CEL粒度分布
将CEL稀释后在激光粒度分析仪上进行测定。结果表明, 脂质体平均粒径为134.3 nm，粒度分布基本符合正态分布规律(图1)。
图1 CEL的粒度分布（略）
Figure 1 Particle size distribution of CEL
2.3 正交实验结果及评价
以药物包封率为评价指标，分析正交实验结果（见表2）。各因素对包封率的影响大小依次为：因素B(药物与总脂质的摩尔比)>因素A(卵磷脂与胆固醇的质量比)>因素C(溶胀用PBS的酸碱度)。最佳配方为A2B2C3，即卵磷脂∶胆固醇(质量比)为5∶1，浅蓝菌素∶总脂质(摩尔比)为1∶8，PBS的pH值为7.4。
2.4 CEL的包封率测定
将优化处方条件下制备的CEL透析去除游离浅蓝菌素后，测定包封在脂质体中的药物含量，并根据投药量计算包封率。经测定，药物包封率为(53.45±3.67)%，药物质量浓度为 (1.126±0.065) mg·mL-1。
2.5 CEL稳定性试验结果
脂质体稀释液离心前后的吸光度分别为0.463和0.437，计算得KE值为0.056。可见脂质体离心前后吸光度变化很小。
冷藏实验结果见表3。结果表明，在4 ℃保存条件下，放置3个月后，脂质体未出现沉淀，药物渗漏率小于5%，具有良好的稳定性。
表3 不同温度保存时CEL的稳定性 (n=3)（略）
Table 3 Stability of CEL stored at different temperatures
2.6 CEL对SKBr3和SKOv3细胞生长的影响
CEL作用较长时间后，细胞生长明显受到抑制，且随着剂量的加大，抑制作用明显增强。作用48 h时，10 μmol·L-1 CEL对SKBr3和SKOv3细胞的生长抑制率分别为45.12%和46.56%，20 μmol·L-1 CEL处理时可达64.49%和75.03%。结果见图2。
■ 对照组; ○ 5 μmol·L-1 CEL处理组; ▲ 10 μmol·L-1 CEL处理组; ▽ 20 μmol·L-1 CEL处理组
图2 不同浓度CEL处理时SKBr3细胞(A)和SKOv3细胞(B)的生长曲线（略）
Figure 2 Growth curves of SKBr3 cells (A) and SKOv3 cells (B) treated by CEL at different concentrations (n=3)
MTT实验结果显示，浅蓝菌素和CEL均呈剂量依赖性抑制SKBr3和SKOv3细胞的体外增殖；且CEL对细胞的增殖抑制作用强于游离浅蓝菌素。CEL对SKBr3和SKOv3细胞的IC50分别为9.62和9.32 μmol·L-1，而游离浅蓝菌素对SKBr3和SKOv3细胞的IC50分别为25.27和28.86 μmol·L-1。结果见图3。
■ 不同浓度CEL处理组; ○ 不同浓度游离浅蓝菌素处理组
图3 不同浓度游离浅蓝菌素和CEL对SKBr3细胞(A)和SKOv3细胞(B)增殖作用的影响（略）
Figure 3 The effects of free Cerulenin and CEL at different concentrations on proliferation at SKBr3 cells (A) and SKOv3 cells (B) (n=3)
3 讨论
本研究将所制备的CEL用0.22 μm的微孔滤膜过滤后再透析并进行其他一系列实验，而不是用0.45 μm微孔滤膜过滤，是因为进行细胞生长抑制实验时试剂也必须经过滤除菌，故粒径大于220 nm的脂质体无法用于细胞实验。实验中也测定了经0.45 μm微孔滤膜过滤后的药物包封率和每毫升CEL中的药物质量浓度，结果包封率为(59.36±3.67)%，药物质量浓度为(1.208±0.104) mg/mL，均略高于经0.22 μm微孔滤膜过滤后的包封率和药物含量，但差异无显著性。其原因可能是粒径大于220 nm的脂质体所占比例较小，故对包封率和每毫升脂质体中药物含量的影响较小。由图1也可以看出，脂质体粒径分布并不完全符合正态分布，粒径小于平均粒径的脂质体所占比例略大一些，表明经0.22 μm微孔滤膜过滤后，粒径大于220 nm的脂质体已被排除。
本研究曾对浅蓝菌素的HPLC测定方法进行了方法学考察（有关方法学数据拟另文发表）。按照参考文献［8］的方法进行分析，发现浅蓝菌素在210 nm处有特征吸收峰，保留时间约为12.7 min，呈独立峰，无干扰，测定方法专属性良好。将浅蓝菌素配制成2×10-6、50×10-6、1 000×10-6 mol·L-1的稀释液各5 份, HPLC分析后, 根据标准曲线方程计算样品中浅蓝菌素的含量, 计算RSD分别为2.76%、1.04%、1.89%，回收率分别为(98.26±2.97)%、(101.19±0.92)%和(102.46±1.86)%。制备的脂质体经透析后，14 000 r/min、4 ℃离心1 h，取上清液进行分析，未检测到浅蓝菌素峰，由此证明游离药物经透析后完全去除。对脂质体的稳定性考察结果表明，4 ℃保存30 d时药物渗漏率不到1％，故认为4 ℃透析24 h造成包封药物的渗漏可忽略。
MTT实验证实，CEL对SKBr3和SKOv3细胞的体外增殖抑制作用明显强于游离浅蓝菌素(见图3)，其IC50分别是游离药物的1/2.6和1/3.1，其机制可能与增加肿瘤细胞药物摄取量有关。首先脂质体及其包裹药物与肿瘤细胞主要通过细胞膜融合作用而被肿瘤细胞内吞［10］，因而肿瘤细胞能有效摄取脂质体，与游离药物进入细胞的方式相比，该方式能增加肿瘤细胞内的药物摄取量。其次，经脂质体包裹后，单位体积样品中药物含量明显增加，本实验中，每毫升脂质体中含浅蓝菌素为1.126 mg，而游离浅蓝菌素在水中的溶解度很小（约为0.3 mg/mL）。增加投药量但不改变溶胀体积是否能进一步增加单位体积中的药物含量，尚有待进一步研究。
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