疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达的影响
表1 各组大鼠血脂的变化（略）
Table 1 Comparison of the levels of blood lipid in different groups
与正常组相比:*P＜0.05, **P＜0.01；与模型组相比:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表2 各组大鼠肝功、FFA和ApoB100的变化（略）
Table 2 Comparison of the levels of serum ALT, AST, FFA and ApoB100 in different groups
与正常组相比:*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比:▲P＜0.05，▲▲P＜0.01
表3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化（略）
Table 3 Comparison of FPS, insulin and insulin resistance index in different groups
与正常组相比:*P＜0.05；与模型组相比:▲P＜0.05；与自然恢复组相比:★P＜0.05
2.4 各组大鼠肝组织学变化
大体观察：模型组大鼠肝脏体积明显增大，包膜紧张，色泽较正常组暗淡，整体呈苍黄色，可见局灶黄白色变性灶，质地偏硬，切面油腻。其他各组大鼠肝体积均有不同程度的增大，呈淡黄褐色，质地、弹性和韧性均较正常组略差。其中，疏肝组、健脾组、综合组要好于自然恢复组。
光镜下正常组大鼠肝脏肝小叶结构清晰，细胞索排列整齐。模型组大鼠肝小叶界限不清，肝细胞索排列紊乱，肝窦消失，出现弥漫性脂肪变性，胞浆中可见大小、数量不一的脂滴空泡，甚者脂滴互相融合，将胞核挤向一侧；小叶内炎症较重，部分大鼠可见数个炎症坏死融合成片。
疏肝组、健脾组、综合组病理改变大致相同，表现为肝细胞轻度脂肪变。自然恢复组大鼠肝组织脂肪变程度较模型组明显减轻，但不如其他药物治疗组改善明显。
2.5 各组大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达及分布情况
2.5.1 PI3K p85α的免疫组化结果 正常组大鼠肝细胞内PI3K p85α表达很少，阳性表达率低；模型组大鼠肝细胞内PI3K p85α的表达强，阳性细胞染色呈黄褐色，主要分布于脂肪变的肝细胞膜和胞浆内，阳性表达率高达90%；其他各组PI3K p85α表达强度依次为自然恢复组＞综合组＞健脾组＞疏肝组，其中药物治疗组染色强度相似，主要分布在脂肪变肝细胞的阳性细胞率逐渐降低。与正常组相比，模型组PI3K p85α表达显著增多（P＜0. 05）；与模型组比较，各药物治疗组PI3K p85α表达显著减少（P＜0.05），以疏肝组PI3K p85α表达降低最明显，自然恢复组PI3K p85α表达也降低，但差异无统计学意义，提示疏肝健脾方药有显著抑制PI3K p85α表达的作用。见表4及图1。
表4 各组大鼠肝细胞PI3K p85α表达比较（略）
Table 4 Comparison of the expression of PI3K p85α in hepatocyte in different groups
与模型组相比:*P＜0.05
A.正常组（×400）;B.模型组（×400）;C.疏肝组（×400）;D.健脾组（×400）;E.综合组（×400）;F.自然恢复组（×400）
图1 各组大鼠肝细胞PI3K p85α的表达情况(SABC法)（略）
Figure 1 The expression of PI3K p85αprotein in hepatocyte in different groups
2.5.2 PI3K p85α的表达与病理分级的关系
χ2检验相关分析表明，PI3K p85α在各组中的表达强度与其病理分级存在正相关（相关系数r=0.671，P=0.000），提示肝组织脂肪变性程度越严重PI3K p85α的表达越强，二者存在明显的相关性。见表5。
表5 肝组织脂肪变性程度与PI3K p85α表达的相关性（略）
Table 5 Correlation between degree of liver steatosis and expression of PI3K p85α
3 讨论
NAFLD是遗传、环境、代谢因素所致肝细胞脂肪变性为主的临床病理综合征。大量流行病学资料显示，NAFLD与肥胖、2型糖尿病(T2DM)、血脂异常等代谢综合征相关疾病密切相关。由于IR是代谢综合征的“共同土壤”［6］，故而推测IR可能也是NAFLD的发病基础。最近研究表明，几乎所有的NAFLD患者都存在周围组织和肝脏的IR ［7］，且IR的严重程度与NAFLD的病情进展相关［8,9］。
研究表明高脂环境诱导的IR伴有胰岛素信号传递通路多个环节表达或活性的异常［10,11］。肝细胞内的胰岛素信号转导通路主要是PI3K信号通路，胰岛素受体后信号转导通路异常是导致IR的最主要的原因。PI3K的改变与IR密切相关。PI3K是脂质激酶的一种，在介导胰岛素刺激的糖代谢反应过程中具有重要的作用。PI3K是由一个分子量85 kDa的调解亚基（p85）和一个分子量110 kDa的催化亚基（p110）组成的异二聚体复合物。p85α是p85表达最丰富的一个亚基。过度表达的PI3K p85亚基能够竞争性抑制p85p110二聚体与胰岛素受体底物1（IRS1）的结合，从而抑制PI3K的活性［11,12］。相反，部分抑制p85亚基表达，提高p85p110二聚体/ p85单体的比例可以改善PI3K介导的胰岛素信号转导［13］， p85α过度表达是营养诱导IR发病机制中一个早期分子步骤［14］。在本实验中，模型组大鼠肝组织中PI3K p85α蛋白的表达明显高于正常组，因此可认为，p85α的表达增多，导致p85与p110比值明显增加，使PI3K的活性下降，从而导致IR的发生，进而引起全身脂质代谢紊乱，脂肪在肝脏的堆积增加。本实验研究表明，模型组大鼠肝指数、肝功、血脂、血糖、胰岛素及IR指数显著升高，说明高脂饮食20周诱导的NAFLD模型存在严重的糖脂代谢紊乱，并出现了IR，与文献报道的结果一致［15］。
与控制高脂饮食治疗相比，疏肝健脾方药联合控制高脂饮食方案治疗NAFLD，对血脂、肝功、血糖的改善作用无明显提高，但在改善IR程度及肝组织病理方面，疏肝健脾方药显示出了良好的作用，其效果明显优于单纯的控制高脂饮食，且其可明显减少肝细胞PI3K p85α蛋白的表达。笔者认为，控制饮食结构的治疗可通过降低血脂、血糖来减轻甚至消除IR，若肝损伤只停留在单纯性脂肪肝阶段，去除外部损伤因素后，肝脏有较强的自身调节、自我恢复的作用；但是疏肝健脾方药能显著减少肝细胞PI3K p85α蛋白的表达，改善IR，说明在NAFLD的中早期，通过控制高脂饮食固然可以降低血糖、血脂，但其改善胰岛素抵抗未起到根本性的作用，疏肝健脾法及其方药能针对胰岛素抵抗的发病机制，充分发挥中医整体综合治疗的优势，以达到改善IR、增加胰岛素敏感性的目的，其具体的作用机制值得进一步研究。
中医学认为肝失疏泄,气机不畅,或脾不健运,水湿内停,湿热内蕴,痰浊郁结,痰瘀阻滞,最终形成湿浊痰瘀互结,痹阻肝脏脉络而形成本病。可见肝郁脾虚是发病的内在基础,湿浊痰瘀为主要病理因素，本虚标实为其病机特点，肝郁脾虚的病机贯穿于NAFLD发病过程的始终［16］。研究发现，肝气郁滞以及在脾虚的基础上，水湿、痰浊、瘀血内生，是IR产生的主要病理机制［17］。根据以方测证的原理，所造大鼠NAFLD模型的中医证候应属肝郁脾虚向痰湿内阻进而痰瘀互结阶段转化，其证候究竟是如何发展转化的，尚需进一步探讨。
【参考文献】
［1］ TARANTINO G, SALDALAMACCHIA G, CONCA P, et al. Nonalcoholic fatty liver disease: further expression of the metabolic syndrome［J］.Gastroenterol Hepatol,2007,22 (3):293-303.
［2］ 杨钦河,周迎春,郭桃美,等. 不同治法方药对脂肪肝大鼠血脂作用的比较研究［J］.新中医,2004, 36（5）:74-75.
［3］ 孟民杰, 杨钦河, 王 强, 等. 不同治法方药对大鼠脂肪肝Kupffer细胞ERK1 /2蛋白活性的影响［J］. 中国病理生理杂志, 2007, 23（8）:1551-1555.
［4］ 段富津.方剂学［M］.上海:上海科学技术出版社,1995:78,114.
［5］ 施新猷.现代医学实验动物学［M］.北京:人民军医出版社,2000:334.
［6］ SANYAL A J, CAMPBELLSARGENT C, MIRSHAHI F, et al. Nonalcoholic steatohepatitis: associationof insulin resistance and mitochondrial abnormalities［J］.Gastroenterology,2001,120(5):1183-1192.
［7］ HAUKELAND J W, KONOPSKI Z, LINNESTAD P, et al. Abnormal glucose tolerance is a predictor of steatohepatitis and fibrosis in patients with nonalcoholic fatty liver disease［J］.Scand J Gastroenterol,2005,40(12):1469-1477.
［8］ 林克荣,杨慧莹,张志坚,等.NAFLD患者血清肿瘤坏死因子α、脂联素水平与胰岛素抵抗的相关性［J］.世界华人消化杂志,2007,15(24):2613-2618.
［9］ 梁冰,陈曦,刘双燕,等.非酒性性脂肪肝与胰岛素抵抗的关系［J］.临床肝胆病杂志, 2006,22(3):213-214.
［10］ SINGH M K,KRISAN A D, CRAIN A M, et al. Highfat diet and leptin treatment alter skeletal muscle insulinstimulated phosphatidylinositol 3kinase activity and glucose transport［J］. Metabolism,2003,52:1196-1205.
［11］ DRAZNIN B. Molecular mechanisms of insulin resistance: serine phosphorylation of insulin receptor substrate1 and increased expression of p85α the two sides of a coin［J］. Diabetes, 2006,55(8):2392-2397.
［12］ BARBOUR L A, RAHMAN S M, GUREVICH I, et al. Increased p85alpha is a potent negative regulator of skeletal muscle insulin signaling and induces in vivo insulin resistance associated with growth hormone excess［J］. J Biol Chem, 2005,280(45):37489-37494.
［13］ LUO J, SOBKIW C L, HIRSHMAN M F, et al. Loss of class IA PI3K signaling in muscle leads to impaired muscle growth, insulin response, and hyperlipidemia［J］.Cell Metabolism,2006,3(5): 355-366.
［14］ CORNIER M A, BESSESEN D H, GUREVICH I, et al, Nutritional upregulation of p85α expression is an early molecular manifestation of insulin resistance［J］. Diabetologia,2006,49(4):748-754.
［15］ 钱俊文,柴可夫.胰岛素抵抗模型形成过程的中医证候动态演变研究［J］.中华中医药杂志, 2006,21(7):430-432.
［16］ 杨钦河，凌家生，平换换，等.非酒精性脂肪肝的中医药防治研究思路与对策［J］.中医杂志,2007,48(8):746-748.
［17］ 宋剑南.从生物化学角度看痰及痰瘀相关［J］.中国中医基础医学杂志,2000,6(3):40-43.