疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病大鼠肝细胞PI3K p85α蛋白表达的影响
作者：杨钦河 欧健 孙升云 乔娜丽 程少冰 陈万群
金玲 杨环文 李娜 纪桂元 谢维宁 林秀峰 张玉佩 薛川松
【摘要】 目的 观察疏肝健脾方药对非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶p85α(PI3K p85α)表达的影响。方法 以高脂饮食12周建立大鼠NAFLD模型后，造模组大鼠再随机分为模型组、疏肝组、健脾组、综合组和自然恢复组等5组。治疗组分别给予相应药物灌胃，其他组给予等量蒸馏水灌胃，模型组继续高脂饮食，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主动脉取血，全自动生化仪检测血脂及肝功，稳态模型法评价胰岛素抵抗程度，光镜下观察各组肝脏病理改变，免疫组化方法检测肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达情况。结果 与模型组相比，药物治疗各组及自然恢复组肝脏脂变程度明显减轻，肝功、血脂、胰岛素抵抗均有显著改善（P<0.05或P<0.01），肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达明显减少（P<0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗各组肝功、血脂、血糖的改善无显著差异，但肝脏脂变程度减轻，胰岛素抵抗指数明显下降（P<0.05），肝细胞内PI3K p85α蛋白的表达显著降低（P<0.05）。结论 疏肝健脾方药对高脂饮食诱导的大鼠NAFLD有较好的治疗作用，其机制可能是与其降低肝细胞PI3K p85α的表达有关。
【关键词】 非酒精性脂肪性肝病 胰岛素抵抗 PI3K p85α 疏肝健脾方药
非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是目前临床上的常见病和多发病，严重影响和威胁着人们的健康。目前认为，它是遗传环境代谢相关性疾病，与中心性肥胖、脂质代谢紊乱、2型糖尿病等代谢综合征疾病密切相关［1］。其发病尚不能以单一的机制解释,可能为多途径、多层次损伤产生的结果，胰岛素抵抗(IR)也被认为是其重要的发病基础。以往的研究发现，疏肝、健脾方药抗脂肪肝作用的效果显著［2,3］。本实验从胰岛素抵抗方面入手探讨上述方药治疗NAFLD的作用效果及其机制。
1 材料和方法
1.1 实验动物
SPF级雄性SD大鼠65只，购自广州中医药大学实验动物中心。实验动物许可证号：SCXK（粤）2005－2004，粤监证字：2007A010，体质量（200±20）g。
1.2 实验药物
柴胡疏肝散：柴胡6 g，川芎5 g，枳壳5 g，陈皮6 g，白芍5 g，香附5 g，炙甘草3 g。参苓白术散：人参15 g，白术15 g，茯苓15 g，薏苡仁9 g，砂仁6 g，山药15 g，桔梗6 g，白扁豆12 g，莲子9 g，炙甘草9 g。以上方药组成、剂量均参照方剂学［4］。上述药物均为三九制药颗粒剂，购自暨南大学附属第一医院中药房。
1.3 饲料
基础饲料购自广东省实验动物中心，高脂饲料的组成为83%基础饲料，10%猪油，5%蔗糖，1.5%胆固醇，0.5%胆盐。
1.4 实验试剂
游离脂肪酸（FFA）试剂盒购于南京建成生物工程研究所，胰岛素放免试剂盒购于中国原子能科学研究院同位素研究所，PI3K p85α一抗（兔抗大鼠）及二抗工作液（羊抗兔IgG）购于武汉博士德生物技术公司。
1.5 动物分组与模型建立
大鼠正常喂养1周后，随机分为正常组（10只）、造模组（55只）。正常组给予基础饲料喂养，造模组给予高脂饲料喂养。12周后，随机抽取造模组5只，取肝组织做病理检测。鉴定造模成功后，将造模组随机分为模型组、疏肝组(柴胡疏肝散)、健脾组(参苓白术散)、综合组（柴胡疏肝散合参苓白术散）、自然恢复组，每组10只，用药组灌药剂量据《现代医学实验动物学》［5］确定，其余各组均给予等量蒸馏水灌胃，同时除模型组继续高脂饮食外，其余均予基础饲料喂养。治疗8周后，各组动物于末次给药后,禁食不禁水12 h，用3%戊巴比妥腹腔麻醉，经腹主动脉取血，分离血清，迅速摘取肝脏，取相同部位肝右叶组织用多聚甲醛溶液固定。
1.6 指标检测
1.6.1 生化指标 用全自动生化检测仪检测血清ALT、AST、TC、TG、LDLC、HDLC、GLU、ApoB100，用FFA检测试剂盒检测血清FFA，血清胰岛素的测定采用放射免疫法。胰岛素抵抗指数（HOMAIR）=空腹胰岛素（μU/mL）×空腹血糖（mmol/L）/22.5，计算值取自然对数变换。
1.6.2 组织病理学检查 取固定液固定的肝组织，大小约2 cm×2 cm×0.3 cm，常规石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察肝脏组织学变化。
1.6.3 肝细胞内PI3K p85α的检测 肝组织石蜡切片用免疫组化（SABC法）方法检测PI3K p85α在肝细胞中的表达及分布情况。
1.7 统计学方法
计量资料以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，PI3K p85α阳性率的比较用χ2检验及Fisher’s确切概率检验。 P＜0.05有统计学意义。所有数据均采用SPSS13.0统计软件进行统计分析。
2 结果
2.1 各组大鼠血清TC、TG、HDLC、LDLC的变化
与正常组相比，模型组TC、TG、LDLC较正常组显著升高（P＜0.01），HDLC显著降低（P＜0. 05）；与模型组相比，各药物治疗组及自然恢复组均显著降低TC、LDLC（P＜0.01）及TG（P＜0. 05），升高HDLC（P＜0.05），提示调整饮食结构可能对NAFLD的早期具有重要意义。见表1。
2.2 各组大鼠血清ALT、AST、FFA和ApoB100的变化
与正常组相比，模型组ALT、AST、ApoB100均显著升高（P＜0.01），FFA明显增加（P＜0.05）；与模型组相比，药物治疗组及自然恢复组ALT、AST、FFA均显著降低（P＜0.01，P＜0.05）；药物治疗各组ApoB100显著降低（P＜0.01），提示疏肝健脾方药可能对脂质代谢具有进一步的潜在作用。见表2。
2.3 各组大鼠空腹血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数的变化
与正常组比较，模型组血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数均显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，各用药治疗组及自然恢复组均可显著降低血糖、胰岛素及胰岛素抵抗指数（P＜0.05）。与自然恢复组相比，药物治疗组胰岛素、胰岛素抵抗指数均有明显降低（P＜0.05），提示所造大鼠NAFLD模型存在IR。见表3。