竹根七中具有血管生成抑制作用有效成分的筛选

　　2.3.2  血管内皮CMC模型的筛选 

　　在上述“筛选条件”下,以ZGQ-3为对照,分别吸取各供试品溶液适量进样分析。结果发现仅有ZGQ-C在柱上有保留(见图2),表明ZGQ-C是ZGQ-3中对血管内皮细胞膜及膜受体有作用的活性成分。

　　2.4  ZGQ-C的药效学实验
   
　　取ZGQ-C适量用DMSO助溶,用RPMI-1640培养基稀释至实验工作浓度,保证DMSO的终浓度低于0.1%[5]。以不同浓度(0.625、1.25、2.50、5.00、10.0 μg/mL)的ZGQ-C作用于培养的ECV304细胞上,以大黄素为阳性对照,溶媒(0.1% DMSO)为阴性对照。细胞增殖实验采用MTT法(四氮唑盐比色法)。
   
　　取对数期生长的细胞,0.25%的胰酶消化3～5 min,吹打成均匀的细胞悬液[6],加入96孔培养板,每孔2×103个细胞,培养24 h后加入不同浓度的供试品,每次每个浓度设6个复孔,并设培养液孔为空白对照。37 ℃、5% CO2湿化培养48 h后,加入5 mg/mL MTT工作液20 μL[7],混匀,37 ℃孵育4 h,取出,小心吸去培养液,每孔加入200 μL DMSO,振荡10 min,酶联免疫检测仪于570 nm处测量各孔的OD值,酶标仪自动打印结果。实验重复3次。抑制率＝(对照组A值－药敏组A值)/(对照组A值－空白组A值)×100%,并绘制药物浓度-抑制率曲线,求半数抑制浓度(IC50)。
   
　　ZGQ-C能明显抑制ECV304的增殖,半数抑制浓度在1.00～1.25 μg/mL范围内,不同浓度的ZGQ-C对ECV304的体外抑制率见图3。

　　3  讨论
   
　　血管的形成与肿瘤的生长、侵袭和转移有着十分密切的关系。大量临床和实验证明,肿瘤的生长和转移依赖于周围毛细血管的生成,在缺乏血管的情况下肿瘤将趋于凋亡坏死,因此阻止肿瘤新生血管生成已成为一种重要的抗肿瘤生长和转移的治疗手段[8]。同时血管内皮细胞是新生血管的前体,因此能抑制血管内皮细胞的增殖,即可起到抑制肿瘤血管的生成。

　　我们选用ECV304,利用其仍能保持典型的内皮细胞形态和部分功能等特性来分离细胞膜并制备细胞膜色谱柱,对大量的中草药进行高通量筛选,寻找对血管内皮细胞有作用的活性成分,并用MTT实验进一步验证其药效。此方法与传统方法相比,具有需样品量少、简单快速、灵敏度高、周期短等优点。
   
　　被研究药物竹根七通过跟踪筛选,得到的ZGQ-C是竹根七中对血管内皮细胞膜及膜受体有作用的活性成分。在ZGQ-C的MTT实验中,阴性组的细胞呈梭形或不规则形,贴壁生长。加药组的细胞形态发生改变,并随浓度和作用时间的变化而呈不同程度的改变,在浓度为1.25 μg/mL、作用时间为6～8 h,光镜下即可见细胞逐渐变成类圆形,间隙加大,胞膜呈断裂状,胞浆出现大量空泡。实验表明，血管内皮细胞膜色谱法筛选结果与药理作用之间存在较好的相关性,因此可以利用此模型对大量的天然药用植物进行快速筛选,以促进血管生成抑制剂候选药物的开发。

【参考文献】
  　　[1] 孙立人,洪 恂,丁绪亮,等.中药大辞典[M].北京：人民卫生出版社， 2001.843.

　　[2] 刘剑平,侯 梅,易 成.羟基喜树碱抑制ECV304细胞的实验研究[J].实用癌症杂志,2002,17(6)：580－582.

　　[3] 赵小娟,党高潮,贺浪冲.用细胞膜色谱法筛选研究淫羊藿地下部分有效成分[J].分析化学,2002,30(1)：74－75.

　　[4] 周幽心,黄 伦,许期年,等.雷公藤单体体外抑制胶质瘤细胞的实验研究[J].癌症，2002,21(10)：1106－1108.

　　[5] 司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安：世界图书出版公司,2000.73.

　　[6] 闫彦芳,张 壮,孙塑伦,等.三七总皂苷及其主要成分对血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用[J].中国实验方剂学杂志,2002,8(1)：34－37.

　　[7] 张覃沐,张 予,李国栋,等.抗肿瘤药物的药理与临床应用[M].郑州：河南医科大学出版社,1999.427－433.

　　[8] SI?N E,Hughes.Functional characterization of the spontaneously transformed human umbilical vein endothelial cell line ECV304：use in an in vitro model of angiogenesis[J].Experimental cell Research,1996,225(1)：171－185.