HPLC法测定不同外植体诱导虎杖愈伤组织中大黄素含量
【摘要】 ：目的 通过HPLC法考察不同外植体对虎杖愈伤组织中大黄素含量的影响。方法 选取MS＋6-BA 0.2 mg/L＋KT 0.2 mg/L＋2,4-D 0.5 mg/L为培养基,分别以虎杖的叶片、茎段、叶柄为外植体,诱导出愈伤组织；采用Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)色谱柱；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：27 ℃；进样量：20 μL。结果 由叶片、茎段、叶柄所诱导的愈伤组织中大黄素含量分别为0.709 6、1.680 0、0.166 8 mg/g,大黄素在0.25～5 μg/mL浓度范围内线性关系良好,r=0.999 85,平均加样回收率为101.19%,RSD＝1.20%。结论 HPLC法可用于愈伤组织中大黄素的含量测定,且由茎段所诱导的愈伤组织中大黄素含量较高。
【关键词】 虎杖 外植体 愈伤组织 大黄素 高效液相色谱法
Abstract：Objective To investigate the effect of different explants on emodin contents in the callus of Polygouum cuspidatum by reverse-phase HPLC. Methods The leafs, stems and leaf stalks of Polygouum cuspidatum were used as explants and induce the callus by MS medium containing 6-BA 0.2 mg/L, KT 0.2 mg/Land 2,4-D 0.5 mg/L. The contents of emodin were analyzed by HPLC. The separation was performed on Diamonsil-C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm) column, using methanol-0.1% H3PO4 (80∶20) as mobile phase, detected at 254 nm. The flow rate was at 1.0 mL/min, the column temperature was 27 ℃. Results The contents of emodin were 0.709 6, 1.680 0 and 0.166 8 mg/g in the callus induced by leafs, stems and leaf stalks. The linear range of emodin was 0.25～5 μg/mL, r＝0.999 85, the average recovery was 101.19% and RSD was 1.20%. Conclusion HPLC method could be used for the contents determination of emodin in Polygouum cuspidatum callus and the contents of emodin was high in the callus induced by stems.
Key words：Polygouum cuspidatum；explant；callus；emodin；HPLC
目前药用植物细胞培养技术发展迅速,已从被研究的400多种植物细胞中分离出600多种次生代谢产物,其中有60多种在含量上超过或等于原植物[1],因此,利用细胞工程技术生产有用的次生代谢物质具有广阔的前景。虎杖(Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.)是蓼科蓼属多年生灌木状草本植物虎杖的干燥根茎和根,性苦寒,归肝、肺、胆经,具有祛风利湿、祛痰止咳、清热解毒、活血化瘀之效。中医临床用于治疗湿热黄疸、肺热咳嗽、疮痈肿毒、关节痹痛、经闭经痛[2]。其根茎富含大黄素、虎杖苷、白藜芦醇等多种活性成分。药理学研究表明,其主要活性成分大黄素具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、平喘等多种功效[3]。本实验通过对虎杖叶片、茎段、叶柄3种不同外植体诱导出愈伤组织,并采用HPLC法测定愈伤组织中大黄素的含量,研究不同外植体对愈伤组织中大黄素含量的影响,从而为利用细胞工程方法生产大黄素提供一定的实验依据。
1 仪器与材料
Agilent 1100 series 高效液相色谱仪；色谱柱：Diamonsil- C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Agilent色谱化学工作站。
大黄素对照品(中国药品生物制品检定所提供,供含量测定用,批号756-9203)；虎杖愈伤组织为安徽省中药研究与开发重点实验室自行培养。甲醇为色谱纯；水为重蒸水；其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 愈伤组织培养[4]
选取健壮无病的虎杖植株,取其叶片、茎段、叶柄,用自来水冲洗干净。晾干后,在超净工作台内用75%酒精消毒30 s,无菌水冲洗1次,然后用0.1% HgCl2溶液消毒8 min,再用无菌水冲洗5次,每次5 min,置无菌滤纸上晾干,切成0.5 cm×0.5 cm的小块,接种在MS＋6-BA 0.2 mg/L＋KT 0.2 mg/L＋2,4-D 0.5 mg/L培养基中,温度(25±1)℃培养,30 d后收获愈伤组织,60 ℃下烘干备用。
2.2 色谱条件的选择及测定
2.2.1 色谱条件[5]
色谱柱：Diamonsil-C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相：甲醇-0.1%磷酸(80∶20)；检测波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱温：27 ℃；进样量：20 μL。在上述条件下,大黄素可与其它组分达到基线分离,见图1。
2.2.2 对照品溶液的配制
精密称取大黄素对照品1.0 mg,以甲醇溶解并定容至10 mL,摇匀,配成100 μg/mL的溶液。