竹根七中具有血管生成抑制作用有效成分的筛选
作者：蒙麦侠 杨智锋 贺浪冲
【摘要】 ：目的 研究竹根七中对人脐静脉内皮细胞株(ECV304)生长有抑制作用的有效成分。方法 用溶剂提取法将竹根七分为不同药用部位,以抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体为对照,用人脐静脉内皮细胞膜色谱模型筛选,并对筛选结果用MTT实验进行分析,以初步确定其中的有效成分。结果 竹根七的分离成分(ZGQ-C)在其浓度分别为0.625、1.25、2.50、5.00、10.0 μg/mL时,对ECV304的增殖抑制率分别为40.51%、51.11%、63.54%、74.32%、81.26%,半数抑制率在1.00～1.25 μg/mL范围内；同时在显微镜下观察到细胞的形态有明显的改变。结论 ZGQ-C是对ECV304有一定抑制作用的有效成分；人脐静脉内皮细胞膜色谱模型的筛选结果与MTT实验结果之间有较好的相关性。
【关键词】 竹根七 细胞膜色谱 ECV304 抑制血管生成
Abstract：Objective To discover the effective component of Rhizoma Tupistrae chinensis with inhibiting angiogenesis. Methods Several parts of Rhizoma Tupistrae chinensis were obtained by using different extraction solvents. They were screened by the model of ECV304 cell membrane chromatography with anti-VEGF antibody as a control drug. The inhibition of effective component (ZGQ-C) on ECV304 proliferation in vitro was examined by MTT assay. Results The inhibition rate (40.51%, 51.11%, 63.54%, 74.32%, 81.26%) was correlated with the ZGQ-C concentration. The ECV304 cell had significantly changed in morphology. Conclusion The ZGQ-C is an effective component for inhibiting angiogenesis. The screening results on the model have a good correlation with that of MTT assay.
Key words：Rhizoma Tupistrae chinensis；cell membrane chromatography；ECV304；inhibiting angiogenesis
竹根七(Rhizoma Tupistrae chinensis)为百合科植物开口箭的根茎,表面黄棕色,有皱纹,断面淡黄白色,细颗粒状,气微,味苦涩。《现代中药大辞典》记载用于劳热咳嗽、咽喉肿痛,腰肌劳损,跌打损伤等[1],民间有用于治疗肿瘤的经验。肿瘤与其血管形成有着密切的关系,其中血管内皮细胞的迁移和增殖是血管形成的关键步骤[2],因此,我们选用人脐静脉血管内皮细胞株(ECV304),建立细胞膜色谱模型,以抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)抗体作为阳性药物,对竹根七进行快速跟踪筛选,寻找与血管内皮细胞膜或膜受体有一定亲合作用的活性成分,并结合MTT实验初步确定其中的有效成分。
1 实验材料
1.1 仪器与试药
Waters高效液相色谱仪,486型紫外检测器,ANASTAR色谱工作站(奥泰科技有限公司)；HERMLE ZK-401型低温冷冻高速离心机(德国)；LKB-2219型循环水浴(瑞士)；DG5031型酶联免疫检测仪(南京华东电子集团股份有限公司)。Tris-HCl、氯化钾、氯化钠、硫酸镁等均为分析纯(西安化学试剂厂)；三重蒸馏水(实验室自制)；柱色谱硅胶和薄层色谱硅胶(中国青岛海洋化工集团)；RPMI-1640培养基(Life Technologics 公司)；小牛血清(杭州四季青公司)；二甲基亚砜(DMSO)、噻唑盐(MTT,Sigma Chemical 公司)；抗 VEGF 抗体(华美生物工程公司)。竹根七药材,采自秦巴山区太白县太白山,由西安交通大学药学院生药学教研室鉴定。
1.2 实验用细胞
ECV304,购自第四军医大学口腔生物学实验室。
2 方法与结果
2.1 筛选条件
自制血管内皮细胞膜色谱柱(50 mm×2 mm,L.D)；流动相：三蒸水；柱温：37 ℃；检测波长：254 nm；流速：0.2 mL/min；用流动相平衡后,即可进样分析。
2.2 竹根七活性部位的筛选
2.2.1 供试品溶液的制备
取竹根七粉末适量,用95%乙醇回流提取3次,每次2 h。合并提取液,回收溶剂至无醇味,浸膏加适量水稀释后,分别用石油醚、乙醚、醋酸乙酯、正丁醇萃取至有机层近无色,得不同极性溶剂萃取液[3-4]。回收溶剂,残渣取少量,用适量甲醇溶解,分别得竹根七的石油醚、乙醚、醋酸乙酯、正丁醇和水的供试品溶液,用ZGQ-1、ZGQ-2、ZGQ-3、ZGQ-4、ZGQ-5表示。
2.2.2 血管内皮CMC模型的筛选
在上述“筛选条件”下,分别吸取各供试品溶液5 μL,在血管内皮CMC柱上进样分析。以抗VEGF抗体为阳性对照,结果发现仅有ZGQ-3和抗 VEGF 抗体类似,在血管内皮CMC柱上有明显的保留峰(见图1)。表明ZGQ-3中含有与人脐静脉内皮细胞膜及膜受体有作用的活性成分。
2.3 竹根七活性部位的分离与确定
2.3.1 ZGQ-3的分离
对ZGQ-3行柱层析,用氯仿-甲醇梯度进行洗脱,依据薄层色谱检识结果收集洗脱液,得不同的分离样品7份。分别用ZGQ-31、ZGQ-32、ZGQ-33、ZGQ-34、ZGQ-35、ZGQ-36、ZGQ-37表示,且ZGQ-35自然析晶得一白色粉末状物质,用ZGQ-C表示。