超声乳化法构建化妆品用熊果苷/透明质酸-己二酸二酰肼交联载药微球
作者：高瑞英 傅中 慕丹 李震
【摘要】 目的研究熊果苷/透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)交联载药微球的制备及性能测定。方法采用超声乳化法，以透明质酸-己二酸二酰肼(HA-ADH)交联衍生物为载体，制备熊果苷/HA-ADH微球。通过倒置生物显微镜、红外光谱仪、紫外分光光度计等对载药微球的形貌结构进行表征，并考察其载药量、包封率及体外释药性能。结果制备的熊果苷/HA-ADH微球成球和分散性好，载药量(DL%)为(8.33±1.52)%，包封率(LE)%为(67.37±1.64)%。较大的微球粒径、孔径，负载量高时具有较好的缓释效果，释放介质温度的变化对其释放行为影响较小。结论HA-ADH载药微球对熊果苷有较好的缓释效果，作为新型美白化妆品功能原料有较大的开发潜力。
【关键词】 超声乳化法; 熊果苷; 透明质酸-己二酸二酰肼; 微球; 制备
化妆品中的活性成分要达到营养、改善皮肤状况和预防皮肤疾病的功效，关键是活性物质必须透过角质层而达到相应的作用部位并维持一定的时间。因此，寻找促进功能性成分经皮吸收的方法成为开发疗效性化妆品的关键之一。天然高分子聚合物微球超微载体技术应用于化妆品生产，赋予了化妆品优异性能[1～7]。
透明质酸(Hyaluronic Acid，HA)是细胞外基质中广泛存在的蛋白多糖成分(分子结构见图1)，具有良好的生物相容性，有望成为理想的缓释、控释功效成分的载体材料。但是，纯HA易溶于水、吸收迅速和在组织中停留时间短等物理和生物特性，限制其作为功能成分载体的使用，需要使用化学交联修饰，以增大其分子量、延长降解时间，提高稳定性[8～14]。
熊果苷(arbutin) 是高效的化妆品美白原料，它在人体内通过抑制酪氨酸酶活性来阻断黑色素前体多巴以及多巴醌的合成，有较好的美白效果。但将熊果苷直接添加到化妆品配方中，其透皮吸收能力不甚理想[15，16]。熊果苷的物理性状为白色针状结晶或粉末，易溶于热水、甲醇、乙醇及丙二醇、丙三醇的水溶液，不溶于乙醚、氯仿、石油醚等，熔点：198～201℃，在酸性条件下不稳定，易被水解。熊果苷有两种差相异构体，即α及β型。分子结构为见图2。图1 透明质酸分子结构α-熊果苷 β-熊果苷图2 熊果苷分子结构
近年来，超声乳化法在现代生物技术中得到了广泛的应用。超声能对不相溶的液-液和液-固非均相体系作用，从而使介质分子达到最大的分散效应。液体介质中，由于涡流或超声波的物理作用，液体中的某一区域会形成暂时负压区，这种空化气泡在液体介质中产生、溃陷或消失而形成空化作用。超声乳化被较普遍地认为是空化作用的结果[17，18]。
本研究采用超声乳化法，以生物相容性极佳的己二酸二酰肼(ADH)作交联剂，制备HA-ADH凝胶，用于包裹熊果苷等美白功效成分，形成天然高分子聚合物微球，增强熊果苷的透皮吸收能力，并达到缓释和提高生物利用度等作用，为化妆品皮肤美白产品提供新型功效性原料。使用紫外-可见分光光度法考察微球在PBS缓冲液中的释药效能。
1 材料与仪器
1.1 材料
熊果苷标准品(湖北襄西化学工业有限公司，化妆品级)，透明质酸(山东福瑞达生物化工有限公司，化妆品级)，已二酸二酰肼(ADH，海曲化工有限公司)，氢氧化钠(NaOH)、氯化钠(NaCl)，液体石蜡(白油)，异丙醇，Span-80，Tween-80，氯化钾(KCl)，磷酸氢二钠(Na2HPO4)，磷酸二氢钾(KH2PO4)。试剂除注明外均为分析纯，实验用水为双蒸水。PBS缓冲液，参照《中国药典》(2005年版)配制，pH值为7.3[19]。熊果苷样品标准溶液，以PBS缓冲液为溶剂，用熊果苷标准品配制浓度分别为1,2,5,10,15,20,25和30μg/ml的样品标准溶液。
1.2 仪器分析天平，超声波细胞粉碎机，低速离心机，恒温振荡器，TP2A型透皮扩散实验仪，移液器(100～1 000 μl)，真空干燥箱，磁力搅拌器，紫外分光光度计，倒置生物显微镜、红外光谱仪。
2 方法
2.1 药物标准曲线的绘制使用紫外分光光度计，在190～400 nm波长范围对20 μg/ml浓度的熊果苷样品溶液进行扫描，确定最大吸收波长λmax。PBS溶液作空白对照，于最大吸收波长λmax处测定不同浓度C熊果苷样品标准溶液的吸收度值A，以A对C作标准曲线。
2.2 熊果苷/HA-ADH微球的制备流程在浓度为1mol/L的NaCl溶液中溶解一定量的熊果苷[用量∶熊果苷/HA=1∶10(g/g)]，配制浓度为0.2%的HA水溶液(CHA)，待溶胀至均匀透明后加入熊果苷/NaCl溶液，用2.5 mol/L的NaOH浓溶液调pH至9。水相中，HA、熊果苷/NaCl和NaOH溶液分别占77%，20%和2%。以液体石蜡为油相介质，加入乳化剂/油相为1/100(g/g)的复配乳化剂(Span-80∶Tween-80=88∶12, V/V)。以水相和油相W/O=1/4(V/V)配成240 ml浊液，加入浓度为0.1%、占水相体积1%的ADH溶液，经400 W声波乳化，工作时间10 s×90次，间歇10 s。用磁力搅拌器搅拌4 h待交联反应基本充分。静置至产物分层，取水相层上方白色乳浊液用异丙醇少量多次洗涤，真空干燥箱中干燥至恒重备用[20，21]。制备流程见图3。图3 熊果苷/HA-ADH微球的制备流程
2.3 熊果苷/HA-ADH微球的表征
2.3.1 熊果苷/HA-ADH微球的表观形态观察将熊果苷/HA-ADH微球乳液滴在载玻片上成单层，自然烘干，400×镜下和1000×油镜下观察微球形态并拍照。
2.3.2 红外光谱分析将干燥的熊果苷原粉、HA-ADH空白微球及熊果苷/HA-ADH微球研磨成粉末，通过KBr压片法制成薄片，用傅立叶红外光谱仪测定产物的红外图谱，分辨率为4cm-1，扫描16次，进行图谱比较。考察活性组分与聚合物之间的相互作用。
2.4 载药量和包封率的测定采用酶解法处理样品，按加入乙醇后的酶解体积推算熊果苷浓度测定值。按式①和式②计算微球的载药量(DL%)和包封率(LE%)。微球载药量(%)=微球中药物的质量微球的质量×100%①微球包封率(%)=微球中药物的质量投药总质量×100%②
2.5 熊果苷/HA-ADH微球的释药性能取负载有活性组分的多孔微球0.5g，用适量pH=7.3的PBS缓冲液分散后，采用TP2A型智能透皮仪测定载药微球释放的活性物浓度。弃去每次取出的溶液，然后向接收池中补充等量的新鲜磷酸盐缓冲液，以维持接收介质的体积不变。活性物的释放持续10 h，按时间间隔和累积释放百分比得到活性物的释放曲线。按式③计算累积释放率：累积释放率(%)=(∑ni=1V×Ci/W)×100%③式中Ci为释放介质中活性物的浓度(mg/ml)，V为每次取样的体积，针对本文为10 ml，W为总的载药量(mg)。
3 结果与讨论
3.1 熊果苷/HA-ADH微球的表征
3.1.1 熊果苷/HA-ADH微球的表观形态观察部分光镜和油镜下的微球形态显微照片如图4所示。A-光镜，400× B-油镜，1 000×图4 熊果苷/HA-ADH微球经干燥后显微镜照片光镜及油镜下可见，熊果苷/HA-ADH微球成球性和分散性好，干燥后可达纳米级。
3.1.2 红外光谱分析图5分别为熊果苷与空白HA-ADH微球、吸附后HA-ADH微球的红外谱图，发现吸附后的微球上均没有明显的新峰出现，说明活性物在微球上的吸附主要为物理吸附。图5 熊果苷、空白微球及载药微球红外光谱分析图空白及吸附后的HA-ADH微球在吸收频率为1 690 cm-1和1 600 cm-1处有强吸收峰，说明生成了-CO-NR2的结构，标志着交联反应的发生。