黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响
【摘要】 目的研究黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及对相关蛋白表达的影响。方法采用体外细胞培养方法，应用MTT法检测黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡作用；通过免疫细胞化学(S-P法)检测凋亡相关基因bcl-2、bax、P53蛋白表达的改变。结果MTT结果表明，黄芩苷在体外对人肝癌HepG-2细胞有明显的诱导细胞凋亡作用，且这种抑制作用呈现浓度和时间依赖性。免疫细胞化学(S-P法)检测凋亡相关基因Bcl-2、P53蛋白表达明显减少、Bax表达明显增加；Bcl-2/Bax比例明显降低。结论黄芩苷对人肝癌HepG-2细胞具有较强的诱导凋亡的作用，其作用机制可能与下调P53基因表达和降低Bcl-2/Bax比例有关。
【关键词】 黄芩苷； 人肝癌HepG-2细胞； 细胞凋亡
随着分子生物学的不断发展，人们对肿瘤的本质和作用机理方面有了更深层次的阐述，抗癌药物研究水平也不断提高。黄芩苷具有抗脂质氧化，降低血脂、血压和抗炎等药理作用［1，2］。本实验对黄芩苷诱导人肝癌HepG-2细胞凋亡及其相关蛋白表达进行了初步研究。现报道如下。
1 材料与仪器
1.1 细胞株HepG-2细胞购于南京凯基生物技术公司。
1.2 药物试剂黄芩苷购于南京青泽医药有限公司；噻唑兰购自美国Sigma公司；RPMI1640培养基购自美国GIBCO公司；小牛血清购自北京华美生物工程公司；胰蛋白酶购自美国DIFCO公司；鼠抗bcl-2、bax及P53单克隆抗体购自福建迈新生物有限公司；免疫细胞化学试剂盒（S-P法）购自福建迈新生物有限公司。
1.3 仪器OLYMPUS倒置显微镜购自日本；RT-2100型酶标仪购自美国；二氧化碳培养箱购自日本HITACHI公司；超净工作台购自上海净化设备厂；PD-2000真彩色病理细胞图像分析仪购自北京天地百年科技公司。
2 方法
2.1 HepG-2细胞培养人肝癌HepG-2细胞贴壁生长，培养于含10％灭活小牛血清，含100 U/ml青霉素及100 U/ml链霉素的RPMI1640培养液中，置37℃、相对湿度90%、5% CO2培养箱内培养。
2.2 MTT比色实验取对数生长期的细胞以每孔105个细胞接种于96孔细胞培养板，每孔培养液200 μl，按照所需要的黄芩苷浓度（终浓度分别为：25，50，100 μg/ml）接种于细胞培养板（瓶），每个药物浓度设4个平行复孔，与试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照孔，另设只加细胞不加药物的阴性对照组，继续培养24，48，72 h后每孔加入 5 mg/ml MTT溶液20 μl，继续培养4 h后终止培养，小心吸弃孔内上清液，每孔加入DMSO 150 μl，振荡混合仪振荡10 min，使结晶充分溶解，选择 492 nm波长酶标分析仪测定每孔光吸收值（A值），计算细胞生长抑制率。
抑制率(%)=（对照孔A值-实验孔A值）/对照孔A值×100%
2.3 免疫细胞化学染色法
2.3.1 爬片的制备取对数生长期的HepG-2细胞，调整细胞浓度，以1×105个/ml的浓度接种于放有多聚赖氨酸预处理的盖玻片的无菌6孔培养板，每孔2 ml。在5%CO2饱和湿度环境下培养细胞24 h，待细胞贴壁生长良好，吸除上清液，实验组加入黄芩苷，终浓度为50 μg/ml，对照组加等量的生理盐水，继续培养48 h后取出细胞爬片进行免疫细胞化学实验。
2.3.2 免疫细胞化学测定取出药物处理后的HepG-2细胞爬片，95%乙醇室温固定30 min；3%H2O2-甲醇，室温孵育20 min，消除内源性过氧化物酶活性；0.1%Tritonx-100室温孵育30 min，利于抗体进入细胞；10%正常山羊血清室温孵育20 min，封闭非特异性抗原；倾去血清，加入50 μl一抗，使其完全覆盖细胞，置于湿盒内，4℃过夜；加入50 μl二抗，37℃，40 min；加入50 μl 三抗，37℃，20 min；DAB显色，显微镜下观察，至阳性显色明显时用自来水冲洗，逐级脱色、透明、中性树胶封片。
2.3.3 结果判断在高倍镜下，每例随机选取5个阳性细胞密度最高的部位，通过真彩色病理细胞图像分析系统，取其平均值作为凋亡相关基因蛋白的阳性表达率。
2.4 统计学处理使用SPSS11.5统计软件，完全随机分组实验所得数据的计量资料采用t检验。完全随机分组实验所得数据的计数资料和率的比较采用χ2检验。
3 结果
3.1 MTT比色实验不同处理组分别培养24，48，72 h，黄芩苷对HepG-2细胞生长有抑制作用，并且随着时间的延长和药物浓度的增加，黄芩苷对HepG-2细胞的抑制效果越明显，药物对肿瘤细胞生长有量-效、时-效关系。结果见表1～2。当黄芩苷浓度为50 μg/ml，作用时间为48 h时，对HepG-2细胞的抑制率为51.241%，接近半数抑制浓度(IC50)。故以后进行的所有实验中黄芩苷的终浓度为50 μg/ml，作用时间48 h为基准设定实验分组并观察各种结果。表1 黄芩苷对肝癌HepG-2 细胞的抑制作用，表2 黄芩苷对肝癌HepG-2 细胞的抑制率(略)