金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染细胞病变及细胞周期的影响

　　3  结果

　　3.1  HCMV病毒感染性滴度不同滴度下，病毒感染的判断。结果见表1。该病毒的滴度（TCID50）为10-3.614。表1  病毒感染性滴度测定（略）

　　3.2  金叶败毒制剂对HCMV感染细胞病变的抑制作用在HCMV感染12 h后就可观察到少许细胞病变，即细胞变大，细胞核及细胞质内可见病毒包涵体，见图1。随病毒感染时间的延长细胞病变不断加重，在病毒感染48 h，细胞病变为“+”，感染168 h后全部细胞发生病变；而金叶败毒制剂组和GCV组在病毒感染72 h后才出现细胞病变，并且进展缓慢，感染168 h后细胞病变仅为“++”,明显轻于病毒对照组。结果见表2。表2  不同感染时间各组细胞病变的比较（略）

　　3.3  金叶败毒制剂对HCMV感染HEL细胞周期的影响

　　
由表3可见，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期的细胞增多，明显多于细胞对照组，病毒感染48 h后，宿主细胞处于G2/M期的细胞明显少于细胞对照组；与细胞对照组比较，自HCMV感染96 h后，随着感染时间延长，宿主细胞均表现为S期细胞明显增多，G2/M期细胞明显减少，而G0/G1期细胞亦明显少于细胞对照组，见表4。由表3～4可见，经金叶败毒制剂干预后，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期细胞明显少于病毒对照组，病毒感染48 h后，宿主细胞处于G2/M期的细胞明显多于病毒对照组；与病毒对照组比较，在HCMV感染72 h后，宿主细胞均表现为S期细胞明显减少，G2/M期细胞明显增多，而G0/G1期细胞亦明显增多。表3  各组感染24 h及48 h与对照组HEL细胞周期分析，表4  各组感染72h及96h与对照组HEL细胞周期分析(略)

　　4  讨论
  
　　中药金叶败毒制剂是同济医院中西医结合研究所研制的一种纯中药制剂，其主要成分为金银花、鱼腥草、大青叶、蒲公英等，经三十余年的基础研究和临床应用证实该药具有抗HCMV及提高机体免疫功能作用［5］，临床使用前的毒性实验和安全性实验均为阴性。

    本研究发现，在HCMV感染12 h后就可观察到少许细胞病变，即细胞变大，细胞核及细胞质内可见病毒包涵体。随病毒感染时间的延长细胞病变不断加重，在病毒感染48 h，细胞病变为“+”，感染72h细胞病变为“++”，病毒感染168h后全部细胞均发生病变。经金叶败毒制剂和GCV干预后，在病毒感染72 h后细胞病变为“+”，并且进展缓慢，感染168 h后细胞病变仅为“++”,明显轻于病毒对照组。表明金叶败毒制剂能明显抑制HCMV引起的细胞病变，与GCV有相近的抗病毒能力。
   
　　HCMV的复制需广泛地改变细胞代谢，造成细胞许多生理改变及基因的活化，HCMV感染能使处于G0/G1期的细胞达到或接近G1/S限制点，对S期感染则导致细胞周期阻滞。处于不同细胞周期的细胞感染HCMV，皆可导致细胞周期的改变，在G0/G1期感染可导致细胞周期进展到G1/S限制点，对S期感染则导致细胞周期阻滞，细胞将不能进行有丝分裂细胞［6］。Barsukova［7］等用HCMV感染二倍体纤维母细胞，在S期感染引起细胞周期进展停滞。本作者在前期的研究中证实中药金叶败毒制剂可促进HCMV感染细胞cyclinD1和CDK4的高表达，诱导宿主细胞通过G1/S调控点，促进细胞周期进程［8］。
   
　　本研究采用流式细胞技术，对HCMV感染人胚肺成纤维细胞进行细胞周期分析，结果显示，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期的细胞明显多于细胞对照组，HCMV感染96 h后，宿主细胞均表现为S期细胞明显增多，G2/M期细胞明显减少，而G0/G1期细胞亦明显减少。该结果表明，在HCMV感染早期，HCMV可促使G0/G1期细胞进展到G1/S限制点，使处于S期细胞增多，在S期细胞感染HCMV则可导致细胞周期阻滞，细胞将不能进行有丝分裂，使大量细胞停留在S期，不能顺利返回到G0/G1期，这与文献报道的结果相符［6］。经金叶败毒制剂干预后，在HCMV感染24 h后，宿主细胞处于S期细胞明显减少，在HCMV感染72 h后，处于S期细胞明显减少，处于G2/M期和G0/G1期细胞均明显增多。该研究结果表明，金叶败毒制剂可促进HCMV感染HEL细胞从S期进展到G2/M期，药物干预后G0/G1期增多表明该药物可促进病毒感染细胞有丝分裂并顺利返回到G0/G1期。
   
　　上述研究结果表明，金叶败毒制剂能明显抑制HCMV引起的细胞病变，促进HCMV感染细胞细胞周期的进程。本研究在一定程度上揭示了该中药的抗病毒作用机制，为临床进一步推广应用该药物治疗HCMV感染提供一定的理论依据。

【参考文献】
  　　［1］王志新，闻良珍，曾万江，等.巨细胞病毒宫内感染对胎婴儿生长发育的影响［J］.中华妇产科杂志，1996，31（7）：412.

　　［2］袁 慧，闻良珍，李 丹，等. 金叶败毒制剂抑制人巨细胞病毒蛋白激酶Pul97的实验研究［J］.中国中西医结合杂志，2005，25（8）：734.

　　［3］李 丹，刘 楠，闻良珍，等. 补锌联合中药治疗育龄妇女巨细胞病毒感染的机理研究［J］.中国优生与遗传杂志，2005，13（5）：94.

　　［4］中国医学科学院流行病防治研究所. 常见病毒病实验技术［J］.北京：科学出版社，1978:34.

　　［5］江汉珍，卢银平，董继华，等. 热毒清抗合胞病毒、流感病毒的实验研究［J］.同济医科大学学报，1996，25(suppl 1):5.

　　［6］刘志峰，方 峰. 巨细胞病毒对细胞周期的影响及其机制［J］.国外医学·病毒学分册，2002，9（4）：105.

　　［7］Barsukova A S, Fedorova N E, Medzhidova A A. Effect of cytomegalovirus on cell cycle progression and formation of pathological mitoses in cultured diploid fibroblases［J］.Ontogenez, 2001, 32(1): 29.

　　［8］袁 慧，刘世新，闻良珍，等. 中药金叶败毒制剂抗人巨细胞病毒感染的作用机制［J］.华中科技大学学报（医学版），2005，34（3）：345.