金叶败毒制剂对人巨细胞病毒感染细胞病变及细胞周期的影响

【摘要】  　　目的探讨中药金叶败毒制剂（简称中药）对人巨细胞病毒（HCMV）感染人胚肺成纤维细胞（HEL）细胞病变及细胞周期的影响。方法用HCMV AD169感染人胚肺成纤维细胞，分别用金叶败毒制剂和更昔洛韦（简称GCV）干预后，用倒置相差显微镜观察不同感染时间细胞病变，并采用流式细胞技术检测HCMV感染及药物干预后宿主细胞周期。结果金叶败毒制剂能明显抑制HCMV感染HEL细胞病变。中药干预组在病毒感染48 h后，HEL细胞处于G2/M期的细胞明显增多,在HCMV感染72 h后，药物干预组 HEL细胞均表现为S期细胞明显减少，G2/M期和G0/G1期细胞明显增多。结论金叶败毒制剂可能通过延缓HCMV感染细胞病变，促进细胞周期进程而发挥抗病毒作用。

【关键词】  金叶败毒制剂； 人巨细胞病毒； 细胞病变； 细胞周期

　　Abstract：ObjectiveTo study the effect of Jinye Baidu Preparation (JBP)，a Chinese medicinal preparation, on the cell pathological change and cell cycle of human embryonic lung fibroblast cells(HEL) infected by human cytomegalovirus (HCMV).
MethodsThe HEL cells were infected by HCMV AD169, the pathological change of the infected cells during different infected time was observed by inverted contrast microscope before and after intervention of JBP and GCV. The cell cycle was detected in the HEL and the infected cells before and after intervention of medicine by the Flow Cytometer. ResultsJBP showed obviously inhibitory action on cell pathological change in the HCMV infected cells. The infected cells in G2/M phase were obvious increased 48 hours after HCMV infection after intervention of JBP. The infected cells in S phase were obviously reduced, and in G2/M phase and in G0/G1 phase they were obviously increased 72 h after HCMV infection after intervention of JBP.ConclusionJBP can delay cell pathological change of the HCMV infected cells, advance the cell cycle process so as to achieve the anti-virus action.

　　Key words： Jinye Baidu Preparation；Human cytomegalovirus；Cell pathological change；Cell cycle
  
　　人巨细胞病毒（HCMV）是目前引起宫内感染的重要病原体之一，HCMV宫内传播与异常妊娠结局（流产、死胎、畸形、胎儿生长受限等）的发生关系密切，已成为影响胎儿发育的常见原因［1］。由于妊娠期HCMV感染尚无有效的治疗药物，本课题组在对金叶败毒制剂和巨细胞病毒感染的长期研究中发现，该中药制剂在体内外对HCMV均有明显的抑制作用［2，3］。本研究采用倒置相差显微镜动态观察感染细胞病变及流式细胞检测技术，探讨中药金叶败毒制剂对HCMV感染的人胚肺成纤维细胞（HEL）的细胞病变及细胞周期的影响，为临床用药提供实验依据。　

　　1  材料与仪器

　　1.1  药物金叶败毒制剂主要成分为金银花、鱼腥草、大青叶及蒲公英等，20 ml/支，每毫升含生药量1 g，批号：950430，由同济医院中西医结合研究所提供,临用时用细胞维持液（含3%DMEM）稀释成不同浓度的溶液。更昔洛韦（简称GCV）粉针剂，25 mg/支，批号：950101，购自湖北省医学工业研究所,临用时用细胞维持液稀释成不同浓度的溶液。

　　1.2  细胞和病毒人胚肺成纤维细胞(HEL)由同济医院围产实验室提供,按常规方法培养、传代，制成单层细胞,第10～20代用于本实验。HCMV AD169标准毒株由湖北省病毒研究所提供，按常规方法传代、滴定,并测定半数组织培养感染量TCID50。

　　1.3  试剂及仪器高糖DMEM培养基，胰酶，胎牛血清等为Promega公司产品，碘化丙啶（PI）染色液为Sigma公司产品。
  
　　仪器： 流式细胞仪FACStar由美国BD公司提供。

　　2  方法

　　2.1  病毒感染性滴度的测定胰蛋白酶消化收集HEL细胞，用10% DMEM培养液配制细胞悬液，0.4%台盼蓝染色后计数活细胞数，调整细胞浓度为 1×104个细胞/ml，接种于 96 孔细胞培养板内，0.2 ml/孔，待细胞长成单层后，同步化12 h；分别接种不同稀释度（10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8，10-9）的AD169病毒，每个稀释度设8孔，每孔25 μl，37℃，5% CO2 培养箱吸附1.5 h后，弃上清，加维持液0.1 ml/孔，同时设细胞对照孔8孔；置37℃，5% CO2 培养箱培养，每日检查病毒生长情况，观察并记录特征性细胞病变（CPE）的孔数，7～28 d后记录结果。按Reed-Muench法［4］计算病毒的半数感染量（TCID50）。

　　2.2  金叶败毒制剂对HCMV感染细胞病变的抑制作用以第10～20代HEL细胞为实验材料，接种于100 ml方培养瓶中，待细胞长成单层后，将100TCID50 的AD169毒株接种于培养瓶中，37℃吸附1.5 h后换液，病毒对照组更换维持液（DMEM-3%FCS）；药物实验组更换用维持液稀释的金叶败毒制剂,终浓度为4 mg/ml；药物对照组更换用维持液稀释的GCV, 终浓度为25 μg/ml。以上各药物及对照组均设3个实验瓶,倒置相差显微镜连续观察各组细胞病变，分别记录感染后12，24，48，72，96，120，144 h细胞病变情况。细胞病变分为: “-”为细胞无病变, “+”为1%～25%细胞病变, “++”为26%～50%细胞病变, “+++”为51%～75%细胞病变, “++++” 为76%～100%细胞病变。

　　2.3  流式细胞术检测细胞周期取第10～20代生长良好的HEL细胞，接种于100 ml方培养瓶中，待细胞长成单层后，同步化12 h。将100TCID50 的AD169毒株接种于培养瓶中，按上述方法处理细胞和分组，同时设细胞对照组，每组均设3个实验瓶。分别于感染后24，48，72，96 h终止培养，用含0.25%胰蛋白酶消化细胞，制成单细胞悬液后用预冷的PBS漂洗两次，800 r/min离心5 min, -20℃预冷的70%乙醇固定（-20℃）24～48 h。PBS洗涤，离心后去除固定液，加碘化丙啶(propidium iodide, PI)染色液（含50 mg/L PI，0.1%Triton X-100, 100 mg/L Rnase A）避光染色30 min后，在流式细胞仪FACStar(美国BD公司)上进行细胞周期分析。

　　2.4  统计学处理数据以±s表示，采用SPSS 11. 5 统计软件包进行t检验。