经前舒对大鼠海马神经元细胞ERβ蛋白和基因表达的影响

【摘要】  　　目的观察经前舒颗粒对大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达的影响，探讨经前舒颗粒治疗经前期综合征（PMS）肝气郁证的作用机制。方法 以束缚造模法复制PMS肝气郁证大鼠模型，给药组给予调肝方药经前舒颗粒，模型组给予灭菌饮用水，并设不造模正常组，取各处理组血清，对体外培养大鼠海马神经元细胞进行干预；采用蛋白质印迹技术（Western blot，WB）和半定量RT-PCR技术分别对各组细胞ERβ蛋白和基因表达变化进行检测。结果模型组血清能显著升高大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达水平，western blot 和RT-PCR检测结果均显示经前舒颗粒含药血清能显著改善PMS肝气郁证模型血清干预的大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达水平异常升高的状况。结论大鼠海马神经元中的ERβ是调肝方药经前舒颗粒的作用靶点之一，经前舒颗粒可能通过降低ERβ蛋白和基因的表达水平而发挥治疗作用。

【关键词】  PMS肝气郁证； 含药血清； 神经元细胞； 雌激素受体β

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of Jingqianshu granule on ERβ protein and gene expression in rat hippocampal neurons and the pathogenesis of PMS with liver-"qi" depression. MethodsPrepare Jingqianshu medicated serum intervene and in  vitro culture hippocampal primary neurons ;then detect the variety of ERβ protein and gene expression with WB and RT-PCR respectively. ResultsThe results of WB and PT-PCR revealed that Jingqianshu granule could improve the abnormal conditions of the expression.ConclusionThe Jingqianshu granule can down-regulate the ERβ protein and gene expression levels in neurons, which may be one of the mechanism to treat PMS with liver-"qi" depression.

　　Key words： Liver-"qi" depression;  PMS;  Medicated serum;  Neural cells;  Estradiol Receptor beta
  
　　经前期综合征（premenstrual syndrome，PMS）肝气郁证是指严重影响正常生活的一组与月经周期密切相关、可预见的经前症状，其主要症状为易激惹、焦虑、抑郁等情绪不稳定的主观症状，其特点为黄体期（月经周期最后两周内）出现症状，月经来潮后症状自行消失［1，2］。PMS肝气郁证是PMS的主要亚型，是肝疏泄不及的表现。经前舒颗粒含白芍、当归、柴胡、白术、丹皮、香附等中药组分具养肝解郁。理气消胀功效，可显著提高PMS肝气郁证临床治愈率。本实验制备大鼠含药血清，并通过Western blot和半定量RT-PCR技术研究了经前舒颗粒含药血清对体外培养大鼠海马神经元ERβ蛋白和基因表达的影响。

　　1  材料与仪器

　　1.1  药物经前舒颗粒（秦皇岛市山海关制药厂生产 批号：Z20053087），灌胃给药，给药量为4.8 g/kg（相当于人临床8倍剂量）。
　　
　　1.2  动物健康SD雌性大鼠，体质量180～220 g，36只;新生SD大鼠（24 h）,均由山东中医药大学实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK（鲁）20050015。

　　1.3  试剂Neurobasal、B27、L-Glutamine（Gibco公司提供)；Fetal Bovine Serum、Poly-D-lysine（Sigma公司提供）；Rabbit polyclonal to ERβ IgG（ab3576），碱性磷酸酶标记羊抗鼠IgG（sc-2005）（Santa Cruz公司）；Donkey polyclonal to Rabbit IgG (HRP)(ab16284)， HRP 标记山羊抗小鼠 IgG（SB100-晶美生物）；RNAisoTMPlus、Taq HS（不含dNTP Mixture）、Rnase Inhibitor、dNTP Mixture、RT反转录试剂盒（宝生物工程大连有限公司提供）；引物：ERβ上游F5′-TCA CCG TCG AGC CTT AGT TC -3′下游R5′-TCT GCA TAG AGG AGC GAT GA -3′（286bp）；内参β-actin 上游F5′-AGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′下游R5′- CAA AGA AAG GGT GTA AAA CG -3′（552bp）（济南博亚生物工程技术服务有限公司合成）。

　　1.4  仪器CO2培养箱（上海力新有限公司）；倒置显微镜（中国重庆光电有限公司）；TECAN酶标仪（上海麦莎生物科技有限公司）；721分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）；凝胶成像分析仪（上海复日科技有限公司）；PCR扩增仪（TAKARA）。

　　2  方法

　　2.1  含药血清的制备筛选动情周期规则的SD大鼠36只进入实验，并随机分为正常组，模型组和给药组，每组12只，饲养于昼夜颠倒环境。根据文献方法［3］并加以改进，将拟造模大鼠（模型组和给药组）前足与对侧后足用无菌纱布捆缚，妨碍其自由活动，以大鼠稍能活动、取食为度。造模同时给药组大鼠给予经前舒颗粒（1 ml/100 g体质量，相当于人临床8倍剂量［4］）。模型组、正常组大鼠给予相同体积的灭菌饮用水，1次/d，连续5 d。造模完毕断头取血，离心，收集血清，-70℃保存。用前56℃、30 min灭活，0.45 μm微孔滤膜滤菌。

　　2.2  大鼠海马神经元培养及细胞相对活力测定参考文献方法［5］，取新生SD大鼠大脑海马区进行神经元体外原代培养，MTT检测神经元存活率。将细胞接种在96孔板中，种植浓度1×106/ml，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，分别在培养24，48 h后全量换液。细胞分3组，分别加入正常组大鼠血清、 模型组大鼠血清、 给药组大鼠血清，使其最终浓度为10%（V/V）。细胞培养72h后，每孔加入20 μl 0.5%MTT溶液；继续培养4 h，去上清，每孔加入150 μl DMSO，置培养箱15 min；用酶标仪于490 nm波长测定各孔吸光度值。细胞培养分组及加入大鼠血清（同前），继续培养24 h，消化收集对数生长期细胞，PBS 洗涤，-70℃放置备用。

　　2.3  蛋白质免疫印迹技术（Western blot）检测大鼠海马神经元中ERβ蛋白表达水平取细胞样品提蛋白， 检测蛋白含量。进行SDS-PAGE, 用水浴式电转仪将凝胶上的蛋白质转印至NC膜上(1 h)，用含5％脱脂奶粉的TBST室温封闭1 h，然后分别与一抗于4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，BeyoECL Plus A液和B液显色，曝光，对ERβ表达情况进行检测。显色过的NC膜用洗脱液室温洗脱15 min，再用β-Actin抗体染色并检测（检测均采用Smartview生物电泳图像分析系统）。

　　2.4  半定量RT-PCR技术检测大鼠海马神经元中ERβ mRNA的表达水平根据RNAisoTMPlus总RNA提取试剂盒操作说明提取总RNA,紫外分光光度仪检测纯度，A260/A280≈1.8，反转录（RT）按照Promega的反转录试剂盒进行操作，PCR扩增条件为：95℃，3 min，预变性；94℃，30 s，变性； ERβ 62℃，内参61.8℃，45 s,退火；72℃，1 min，延伸；再72℃，7 min，延伸。循环参数为：ERβ为33，内参为25。PCR产物于2%琼脂糖凝胶电泳，应用Smartview生物电泳图像分析系统进行光密度扫描。

　　2.5  统计方法利用SPSS 11.5统计软件进行单因素方差分析及LSD法检验以统计数据，所有数据均用±s表示，显著性水平为P<0.05。