苦参碱对HL-60细胞增殖与分化影响的实验研究

                   作者：李玉红，许浪，晏丹，刘丹

【摘要】  　　目的观察苦参碱对HL-60细胞增殖和分化的影响作用。方法以HL-60细胞为实验对象, 采用体外培养技术, 通过MTT法测细胞活力、细胞周期分析、细胞凋亡检测、硝基四氮唑蓝（NBT）还原试验、细胞表面分化抗原检测等方法来观察不同浓度苦参碱对HL-60细胞的作用。结果浓度为 12.5～ 50 μg/ml的苦参碱能明显抑制HL-60细胞的增殖，使细胞周期发生改变，G0/ G1 期细胞增多，S期细胞减少，凋亡细胞明显增多，对NBT的还原能力增强，细胞表面分化抗原CD11b和CD15表达增加。结论苦参碱对白血病细胞具有一定的抑制增殖、诱导凋亡和诱导分化作用，对白血病的治疗提供有力的实验依据。

【关键词】  苦参碱； HL-60细胞； 增殖； 分化

　　苦参碱 (matrine, MAT)是传统中药苦参的有效成分, 研究报道苦参碱类药具有显著抑制肿瘤增殖、诱导肿瘤分化和凋亡、抗肿瘤浸润和远处转移、抑制肿瘤新生血管形成、减轻肿瘤炎症和抑制肿瘤耐药性、减低化疗不良作用、增强肿瘤宿主免疫等功能［1］。本实验观察苦参碱对HL-60细胞增殖与分化方面的影响，并对其作用机制进行初步探讨，以期对白血病的治疗提供一些新的思路。

　　1  材料与方法
　
　　1.1  细胞系和主要试剂HL-60细胞系为武汉大学流行病学实验室所赠，苦参碱购于广州明兴制药有限公司，用RPMI1640培养基稀释，过滤除菌保存, 临用时用适量的培养基稀释至实验所需浓度。RPMI1640培养基为GIBCO公司产品，硝基四氮唑蓝(NBT)为上海前进化学试剂厂产品，PE标记的小鼠抗人CD11b单抗和FITC标记的小鼠抗人CD15单抗购于晶美生物工程有限公司。

　　1.2  细胞培养及苦参碱处理HL-60细胞培养于含 10%小牛血清的RPMI 1640 培养基中。置 37 ℃、饱和湿度的5 %CO2孵箱中培养，2～3 d换液传代 1 次，取对数生长期的细胞进行实验，实验细胞起始接种浓度为 1 ×105 /ml。将细胞分为4组，分别加入苦参碱使其终浓度为0（对照组），12.5， 25，50 μg/ml进行后续观察。

　　1.3  MTT法检测细胞活力台盼蓝染色记数活细胞＞95%后，将细胞转入96 孔培养板培养，每孔加入用不同浓度的苦参碱处理72 h的细胞悬液200 μl，设重复孔3个，向各孔中加入 20 μl 的 MTT(5 mg/ml)溶液，37℃, 5%CO2 培养箱孵育 4 h后，终止培养，平板离心弃上清，每孔加100 μl DMSO，微量振荡器振荡10 min，使结晶物充分融解，显微镜观察至甲臜充分溶解后， 用国产DG3022 型酶标仪测各孔在波长570 nm和630 nm处的OD值， 将OD570减去OD630 即为测定结果。

　　1.4  细胞周期分析分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72 h的HL-60细胞，离心5 min，弃上清液，PBS 洗涤两次, 每份样品加RNase 100 μl，PI ( 含0.1%Triton-X100)300 μl 单染30 min，37℃避光保存，经流式细胞仪检测细胞周期时相分布，上机时300目尼龙网滤过，计数10 000个细胞。

　　1.5  流式细胞仪检测细胞凋亡率分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72 h的HL-60细胞，离心 5 min，弃上清液，PBS 液洗涤细胞两次。用结合缓冲液将细胞浓度调整为1×106/ml，取 100 ml，加入5 μl Annexin V和10 μl PI溶液，混匀，室温避光孵育15 min后加入400 μl缓冲液，上机检测。正常活细胞为: Annexin V（-）/PI（-），早期凋亡细胞:  Annexin V（+）/PI（-），晚期凋亡细胞和坏死细胞: Annexin V（+）/PI（+），机械性损伤细胞 : Annexin V（-）/PI（+）。

　　1.6  NBT还原能力测定分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72 h的HL-60细胞，离心5 min，弃上清液，PBS 液洗涤细胞两次，调整细胞浓度为1×106细胞，加0.5 ml含0.1％NBT及200 ng/ ml鞣酸(TPA)的生理盐水，37℃保温60 min，离心弃上清，将沉淀细胞均匀涂片，Wright-Giesma染色，油镜下计算阳性细胞数。

　　1.7  细胞表面分化抗原检测分别收集上述经不同浓度苦参碱处理72 h的HL-60细胞， 离心5 min，弃上清液，PBS 液洗涤细胞两次，调整细胞浓度为1×106细胞，分别加入PE标记的小鼠抗人CD11b单抗、FITC标记的小鼠抗人CD15单抗1 ml，混匀后避光反应20 min, 用PBS洗液洗涤，离心，加0.5 ml PBS洗液重悬细胞，流式细胞仪检测。

　　2  结果

　　2.1  苦参碱对HL-60细胞的生长抑制如图1所示，苦参碱对HL-60细胞生长抑制作用呈浓度依赖性，12.5 μg/m l的苦参碱显示具有明显抑制作用，随着浓度的增加其抑制作用进一步增强，与对照组有明显差异。

　　2.2  苦参碱对HL-60 细胞周期影响流式细胞仪检测不同浓度苦参碱作用HL-60 细胞72 h 后的细胞周期分布，各期细胞比例见表1。苦参碱处理72 h 后与对照组比较，G0/ G1 期细胞增多，S 期细胞明显减少，提示苦参碱可阻止HL-60细胞由S 期向G2/ M 期的进程，阻滞细胞的有丝分裂，使细胞发生S 期阻滞，且随苦参碱浓度增加，G0/ G1 期细胞增多和S 期细胞减少越明显(P< 0.01) 。表1  不同浓度苦参碱作用72 h 后HL-60细胞周期分布（略）

　　2.3  苦参碱对HL-60细胞凋亡的影响Annexin V -FITC /PI双染法FCM 检测显示, 不同浓度苦参碱作用72 h对HL-60细胞凋亡率Annexin V（+）/PI（-）的影响(n=3)见表2。如表2所示，不同浓度苦参碱作用后，细胞凋亡率明显高于空白对照组(P<0.01)，且随着浓度的增加，凋亡率从15.24%增加到33.43%。表2  各浓度苦参碱作用72 hHL-60细胞凋亡率（略）

　　2.4  苦参碱对HL-60细胞NBT还原能力的影响成熟粒细胞在波佛酯的激发下能使可溶性淡黄色NBT还原为不溶性蓝紫色沉淀，沉积于细胞质内，未分化细胞呈NBT反应阴性，计算阳性细胞可间接反映细胞分化成熟程度。未经药物处理的细胞NBT反应呈阴性，不同浓度的苦参碱可使HL-60细胞对NBT产生不同的还原能力，以25 μg/ml浓度NBT阳性率最高，（见表3）。各药物组与对照组有明显差异。表3  苦参碱对HL-60细胞NBT还原能力的影响（略）
　
　　2.5  苦参碱对HL-60细胞表面分化抗原还原CD11b、CD15的影响对照组HL-60细胞能表达一定量的表面抗原CD11b、CD15，不同浓度苦参碱处理72 h后，HL-60细胞表面抗原CD11b、CD15都出现一定程度的增加，如图2所示。