响应曲面法优化三叶青总黄酮提取工艺研究
3.2响应面试验结果与分析
3.2.1提取剂浓度、液料比和提取时间的优化试验结果单因素试验结果表明，在10~90%范围内，乙醇体积分数为30%时提取率最高;液料比在5~25 ml/g 范围内，20 ml/g 时提取率最高。提取时间在0.5~3 h范围内，3 h时提取率最高，但提取时间超过2 h，提取率增加速度趋缓。以乙醇溶液为提取溶剂，提取条件的响应面分析试验设计及结果见表2。试验号1，2，3，4，5，6，7，9，10，11，14，15 是析因试验，试验号8，12，13 是中心试验。其中析因点为自变量取值在C、R、t所构成的三维顶点;零点为区域的中心点，零点试验重复3次，用以估计实验误差。表2BBD设计和实验结果
3.2.2回归分析对试验数据进行响应曲面回归分析。结果见表3。表3实验数据的二次响应面模型和回归分析当“Prob >F”值小于0.05 时，即表示该项指标显著，而对三叶青总黄酮提取率方差分析(表3)结果表明，对总黄酮提取率所建立的回归模型是显著的。并且该模型的R2=0.950 2，说明此模型与实际试验拟合较好，试验失拟项小，因此可用该回归方程代替试验真实点对实验结果进行分析。
3.2.3拟合模型的建立以供试液的吸光度(A)为响应值，经回归拟合后，各因子与响应值的回归方程为：A=-0.584 53+8.356 25E-003C+0.037 208R+0.330 58t-6.000 00E-005C × R-1.500 00E-004 C t+2.100 00E-003Rt-1.223 96E-004C2-9.283 33E-004×R2-0.086 833t2
3.2.4响应面(RSM)分析响应曲面图是响应值对各试验因子C、R、t所构成的响应面图形，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。本实验根据回归方程进行不同因子的响应面分析。结果图1~3。通过软件分析，得到热回流提取三叶青总黄酮的最佳条件为乙醇浓度28%，液料比为22 ml/g，提取时间为2.2 h。在此条件下，总黄酮单次提取供液吸光度的理论预测值为0.286。
3.2.5验证性试验为检验RSM法的可靠性及稳定性，精密称取5份药材样品按上述最佳提取工艺进行验证试验,操作方法同前述。 结果供试液的吸光度分别0.289，0.281，0.274，0.285，0.291，平均值为0.284，单次提取总黄酮的提取率为0.22%，RSD=2.4%(n=5)。与理论预测值比较误差在3%以内。因此，采用RSM法优化得到的提取条件参数准确可靠，具有实用价值。图1乙醇浓度和液料比对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图图2乙醇浓度和提取时间对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图图3液料比和提取时间对三叶青总黄酮提取影响的曲面图和剖面图
3.2.6提取次数的考察在已优化的单次提取条件下,考察不同提取次数对总黄酮提取率的影响。结果如图4所示,提取2次后总黄酮的提取率为0.30%，已提出总黄酮的88% ,从生产工艺的角度考虑,选用提取次数为2次。图4提取次数对三叶青总黄酮提取率的影响
4讨论
本试验所用三叶青中总黄酮的含量测定方法经方法学考察，精密度、稳定性及加样回收试验均符合规定。三叶青总黄酮含量测定方法选用Al(NO3 ) 3 - NaNO2 - NaOH 显色后,明显生成红色絮状沉淀，此法不宜采用。而用AlCl3显色后，芦丁标准液的λmax = 410 nm，样品溶液的λmax = 400 ～410 nm，故选择AlCl3显色后410 nm 波长处测定吸光度。以乙醇溶液为提取溶剂，采用热回流法提取三叶青中的总黄酮，考察了乙醇浓度、液料比、提取时间等对三叶青总黄酮得率的影响,并结合BBD实验设计得到了最优提取工艺参数: 乙醇浓度为28%，液料比为22 ml/g ,提取时间为2.2 h，提取2次。在此条件下, 三叶青总黄酮提取率为0.30 %。经验证试验证明用该工艺提取三叶青总黄酮工艺简单、稳定性好。本次实验优选出来的实验条件,对今后开发利用三叶青中的总黄酮具有一定的指导意义。
【参考文献】
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