银杏酸平衡溶解度和表观油水分配系数的测定

                   作者：杨小明，梁健 王驰芳，高倩

【摘要】  目的测定银杏酸在水、缓冲溶液、有机溶剂中的平衡溶解度，及在正辛醇-水和正辛醇-缓冲液体系中的表观油水分配系数。方法采用高效液相法测定银杏酸的浓度，采用摇瓶法测定银杏酸的表观油水分配系数。结果25 ℃银杏酸在水中的平衡溶解度为0.886 8 mg·L-1;在酸性缓冲溶液中的平衡溶解度较水中略有增加;在碱性缓冲溶液中的平衡溶解度随pH上升增加显著。银杏酸在甲醇、乙醇、正丁醇和正辛醇中平衡溶解度均大于35 g·L-1。37 ℃银杏酸的正辛醇-水表观油水分配系数为14.2 (lg Papp = 1.15);在正辛醇-pH 2.0磷酸盐缓冲液中表观油水分配系数较大[307.2(lg Papp =2.49)]。结论银杏酸的脂溶性好，水溶性差，增大pH值可增加银杏酸的水溶性。

【关键词】  银杏酸;平衡溶解度;表观油水分配系数;高效液相色谱法

　银杏酸(Ginkgolic acid)是从银杏Ginkgo biloba L.中分离得到的酚酸类化合物，为6-烷(烯)基水杨酸的衍生物，其苯环6位碳链长度13-17，双键数0-2，其结构见图1。银杏酸具有广泛的生物活性，如抗肿瘤、抑菌、杀钉螺等[1~4]，其抑制肿瘤细胞的生长机理为诱导肿瘤细胞的凋亡[4，5]。寻找肿瘤细胞凋亡诱导剂是开发新型抗肿瘤药物的途径之一，许多抗肿瘤药物的作用机制就是基于诱导肿瘤细胞凋亡[6]，因此银杏酸被认为是一具有良好前景的抗肿瘤药物，有必要进行新药的制剂研究。本课题组前期已建立了小鼠血浆中银杏酸浓度的高效液相测定方法[7]，但目前尚未见有银杏酸平衡溶解度及油水分配系数等理化性质的报道，而药物的物理化学参数与其在生物体内膜渗透性具有相关性，有助于预测药物动力学性质[8]。本文中作者对银杏酸的平衡溶解度、表观油水分配系数等理化参数进行测定，为银杏酸吸收代谢研究、新剂型的开发以及其他药学研究提供参考。图1银杏酸结构式

　　1仪器与试剂

　　美国VARIAN公司ProStar高效液相色谱仪：Prostar 210双泵，Prostar 325 UV 检测器，手动进样器，20 μl定量环;Star WS V6.3化学工作站;DF-101S 恒温加热磁力搅拌器(巩义市予华仪器有限责任公司);超级恒温槽;THZ-82水浴恒温振荡器(江苏金坛市中大仪器厂);H-1650高速离心机(长沙湘仪离心机仪器有限公司);PHS-2C 酸度计(上海理达仪器厂)。银杏酸样品由本实验室自制，总银杏酸含量>98%，银杏酸的组成和含量为C13:0, 20.7%; C15:0, 3.3%; C15:1, 51.6%;C17:1, 21.1% and C17:2, 3.3%。甲醇(色谱纯，由上海医药集团提供);其余试剂均为分析纯，水为娃哈哈纯净水。

　　2方法与结果

　　2.1色谱条件色谱柱：SinoChrom ODS-AP C18(250 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相：甲醇-3%HAc(92∶8);流速1 ml· min-1;检测波长310 nm;柱温40℃。在上述色谱条件下，银杏酸的5个单体实现了基线的完全分离。结果见图2。图2银杏酸的HPLC图

　　2.2银杏酸标准曲线的建立准确称取25 mg银杏酸，置于25 ml容量瓶中，加入适量以甲醇溶解后，加甲醇至刻度，摇匀得质量浓度为1 mg·ml-1的储备液。精密量取一定量储备液于10 ml容量瓶中，加甲醇配成25，50，100，150，200 mg·L-1的系列标准溶液，分别进样20 μl，记录峰面积，以银杏酸峰面积之和A为纵坐标，银杏酸浓度C(mg·L-1)为横坐标进行线性回归，得银杏酸的线性回归方程为：A=9.314C+323.7，r=0.999 5，结果表明银杏酸在25~200 mg·L-1内浓度与峰面积之和呈良好的线性关系。另量取一定量的100 mg·L-1银杏酸溶液于10 ml容量瓶中，加甲醇配成0.25，1，5，10，15，20，25 mg·L-1的系列标准溶液，同法得银杏酸的线性回归方程为：A=11.52C+8.641，r=0.999 6，结果表明银杏酸在0.25~25 mg·L-1内也呈良好的线性关系。

　　2.3精密度实验取质量浓度分别为100，15 mg·L-1的银杏酸溶液按“2.1”项条色谱条件连续进样6 次，计算相对标准偏差(RSD)，结果RSD分别为1.93%和1.27%，均小于2 %，表明该方法的精密度良好。

　　2.4平衡溶解度的测定将过量的银杏酸置于10 ml具塞玻璃试管中，分别加入适量水、pH 2.0，3.0，4.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的磷酸盐缓冲溶液，以及甲醇、乙醇、正丁醇和正辛醇，于恒温水浴中搅拌至银杏酸浓度稳定，恒温静置24 h后离心、过滤，进样20 μl;超出线性范围的样品用适当甲醇稀释后进样，记录峰面积。按外标法以5个峰面积之和计算银杏酸在各介质中的平衡溶解度。银杏酸在25℃，37℃水中的平衡溶解度分别为0.886 8 mg·L-1和1.397 mg· L-1。在25 ℃不同pH磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度见图3。银杏酸在水、酸性磷酸盐缓冲溶液(pH6.0)中的平衡溶解度较低;而在碱性磷酸盐缓冲溶液中的平衡溶解度随pH上升明显增大，在pH 10.0和pH 11.0的缓冲液中银杏酸的平衡溶解度分别达到52.36 mg·L-1和81.21 mg·L-1。银杏酸在各种常见有机溶剂中的平衡溶解度分别为：甲醇 35.33 g·L-1;乙醇39.07 g·L-1;正丁醇123.5 g·L-1;正辛醇136.2 g·L-1，溶解度随着溶剂碳链长度的增加而增加。图3银杏酸在25 ℃条件下不同pH溶液中的平衡溶解度

　　2.5表观油水分配系数的测定取银杏酸适量溶于水饱和的正辛醇中配成质量浓度为100 mg·ml-1的正辛醇溶液。取该溶液1 ml置于具塞试管中，分别加入正辛醇饱和的水、pH 2.0，3.0，4.0，5.0，5.2，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0的磷酸盐缓冲液，(37±1)℃水浴恒温振荡器中振荡直至平衡，以3 000 r·min-1离心10 min，取下层水相过滤，进样20 μl，记录峰面积，代入标准曲线计算水相银杏酸的浓度ρw;另取100 μl正辛醇相于10 ml的容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，将该溶液用甲醇再稀释100倍后过滤，进样20 μl，记录峰面积，代入标准曲线计算油相银杏酸的浓度ρo。按公式Papp=ρo/ρw计算表观油水分配系数。银杏酸溶于37℃正辛醇饱和的水中，测得其pH值为5.2，正辛醇-水表观分配系数Papp为14.2 (lg Papp =1.15)。银杏酸在强酸性缓冲液中的表观油水分配系数较大(pH 2.0，lg Papp =2.49)，但随pH增加lg Papp逐渐降低，在pH 8.0出现最小值(lg Papp=0.81);pH 9.0后略有上升(lg Papp =1.20)，直至pH 11.0，其表观油水分配系数再无明显改变。银杏酸在不同pH缓冲溶液中表观分配系数见图4。图4银杏酸在37 ℃条件下不同pH缓冲溶液中的表观分配系数