紫菀的毒性部位及对小鼠的急性肝损伤作用研究

                   作者：王蕾，张勉，金晶，黄芳，张朝凤

【摘要】  目的分离富集紫菀的毒性成分，研究毒性部位的肝脏急性毒性。方法采用柱层析色谱法分离，以小鼠急性毒性为指标，筛选出紫菀的毒性部位，并测定了LD50。小鼠急性肝脏毒性研究方法主要采用的是血清生化指标(ALT，AST，TBIL)检测和肝组织病理切片检查。结果经硅胶柱层析分离富集，得到紫菀的毒性部位Fr2，其LD50为0.052 g/kg。与对照组比较，单次给药后，LD0剂量组小鼠血清ALT、AST均有显著升高，TBIL没有显著差异。组织病理学检查结果表明，紫菀毒性部位LD0剂量可引起小鼠肝脏轻度细胞水肿，可见肝细胞点状坏死、肝小叶及汇管区见有炎细胞浸润;LD100剂量下可引起小鼠肝细胞呈不同程度脂肪变性、细胞水肿，可见肝细胞坏死、肝小叶及汇管区均见有炎细胞浸润。结论紫菀毒性部位的LD50为0.052 g/kg，单次给药小剂量对小鼠肝脏有轻微损伤，大剂量可引起小鼠较为严重的急性肝损伤并致死。

【关键词】  紫菀;毒性部位;LD50;急性肝损伤

　Abstract：ObjectiveThe ethyl acetate (EtOAc) part of 90% ethanol extract of Radix Asteris (RA) showed strong toxic effect (LD50 0.19 g/kg) to mice in our previous investigation. This paper aimed to obtain a refined toxic part from the EtOAc part, and to investigate the acute hepatotoxicity of this toxic part to mice.MethodsThe toxic part was searched by comparing the toxicity of the combined fractions through the gel silica column chromatography using the death of mice as index. LD50 of the toxic part was determined. The acute hepatotoxicity of the toxic part to mice was measured by biochemical indicators (ALT, AST and TBIL) in serum and histological examination of liver.ResultsFr2 fraction obtained from the EtOAc part was confirmed as the toxic part and its LD50 was 0.052 g / kg. The acute hepatotoxic test of the toxic part in a lower dose (LD0) showed that ALT, AST were significantly increased but TBIL had no obvious changes as compared to control group. Histological examination showed that a lower dose (LD0) of Fr2 could induce slight edema and spotty necrosis of liver cell, as well as phlogocyte infiltration; and a higher dose (LD100) could induce serious liver injury in mice.ConclusionThe value of LD50 (0.052g/kg) indicate that Fr2 is the refined toxic fraction of RA. The results of biochemical indicator test and histological examination confirmed the acute hepatotoxicity of Fr2 which induced more serious liver injury to mice given a higher dose than given a lower dose.

　　Key words：Radix Asteris;Toxic part;LD50;Acute liver injury

　　紫菀(Radix Asteris)为菊科植物紫菀Aster tataricus L. f.的干燥根及根茎，辛、苦、温，具有润肺下气、消痰止咳的功效，用于痰多喘咳，新久咳嗽，劳嗽咳血[1]。历代本草及现代中医药专著均沿袭了其无毒的说法。本课题组前期研究中发现，紫菀水煎液灌胃给予小鼠有一定的急性毒性和肝脏毒性[2];进一步的研究表明，紫菀以90%乙醇提取毒性最强，通过毒性部位的追踪，发现其醋酸乙酯部位为紫菀的粗毒性部位(LD50为0.19 g/kg) [3]。本实验在前期工作的基础上，仍以小鼠急毒为筛选指标，对醋酸乙酯部位进一步细分，得到毒性成分更集中的部位，并首次研究其对小鼠的肝脏毒性。

　　1材料与仪器

　　1.1动物昆明种小鼠，雄性，体质量18～22 g，由南京青龙山实验动物中心提供。

　　1.2药物及试剂紫菀购自河北省安国市药材市场，经中国药科大学生药学研究室张勉教授鉴定，凭证标本保存于中国药科大学生药学研究室。提取溶剂为市售90%工业酒精;石油醚、醋酸乙酯、甲醇、氯仿均为市售分析纯;薄层色谱硅胶及柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂生产。谷丙转氨酶测定试剂盒(ALT)，批号：20091112，谷草转氨酶测定试剂盒(AST)，批号：20091112，血清总胆红素测定试剂盒(TBIL)，批号：20091112，均为南京建成生物工程研究所产品。

　　1.3仪器旋转蒸发仪，瑞士Buchi实验仪器公司产品，型号：R-2000;数显恒温水浴锅，国华电器有限公司产品，型号：HH-4;电子天平，型号：PL303，Matter - Toledo Group;医用数控超声仪，型号：KQ - 250DE，昆山超声仪器有限公司产品。高速冷冻离心机，型号：TLG-16，湘仪集团;1500酶标仪，Thermo Electrom 公司产品。

　　2方法

　　2.1紫菀各部位的制备方法紫菀药材粉碎成粗粉，分别用10，8，8倍量90%乙醇回流提取3次，每次1 h，合并提取液，减压回收乙醇至无醇味的稠膏状，加水混悬，依次用石油醚和醋酸乙酯萃取，得到紫菀醋酸乙酯部位。取醋酸乙酯部位浸膏，采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，各流分根据薄层色谱结果合并，得到A-1、A-2、A-3三个部分，各部分均以1 g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2 ml/10g，进行急性毒性实验。取A-2部位浸膏，采用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，收集各极性段的流分根据薄层色谱结果合并，得到Fr1、Fr2、Fr3三个部分。各部分均以0.4 g/kg(浸膏量)给药，给药体积0.2 ml/10g，进行急性毒性实验。

　　2.2急性毒性实验方法健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。实验前禁食12 h，不禁水，灌胃给予相应的药物，一次给药;空白组给以相同体积的0.5% CMC-Na。给药0.5 h后开始观察小鼠的中毒体征。连续7 d观察小鼠死亡情况，随时取出死亡小鼠，记录死亡时间。

　　2.3紫菀毒性部位小鼠LD50测定实验由预实验测得紫菀毒性部位的LD0和LD100分别为0.023 g/kg和0.10 g/kg，由此确定组间剂量比值为0.75，即Fr2部位0.023，0.030，0.040，0.053，0.071，0.10 g/kg共6组(分别编为1，2，3，4，5，6组)。

　　2.4紫菀毒性部位急性肝损伤实验健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。灌胃给予LD0剂量的紫菀毒性部位，给药体积0.2 ml/10g，空白组给予相同体积的0.5% CMC-Na溶液。给药后禁食12 h，不禁水，摘眼球取血，3 500 r/min离心10 min，取血清备用，解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE染色，进行组织病理学检查。按照试剂盒说明书操作测定血清中谷丙转换酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和总胆红素(TBIL)的含量。实验数据采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。　健康昆明种雄性小鼠，随机分组，每组10只。灌胃给予LD100剂量的紫菀毒性部位，给药体积0.2 ml/10 g，空白组给予相同体积的0.5% CMC-Na溶液。给药组待小鼠死亡后解剖取肝脏，10%福尔马林溶液固定，HE染色，进行组织病理学检查。　组织病理学检查判断标准：根据病变程度，记为“-”“+”“++”“+++”。“-”表示无明显病变;“+”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占25%，肝细胞点状坏死，肝小叶内或汇管区少量的炎细胞浸润及肝细胞增生;“++”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞约占50%，细胞碎片状坏死，小叶内或汇管区中等量的炎细胞浸润;“+++”表示肝小叶内肝细胞水肿或肝细胞脂肪变性的细胞数约占75%或以上，桥接状坏死或大片坏死，肝小叶内或汇管区大量的炎细胞浸润或淋巴滤泡形成。