活血通脉灵对异丙肾上腺素致心肌缺血大鼠VEGF、bFGF表达的影响

                作者：杜英 淮丁华 杨艺全 商小涓

【摘要】  目的探讨活血通脉灵(HXTML)对异丙肾上腺素(ISO)所致心肌缺血大鼠血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的影响。方法将50只Wistar雄性大鼠随机分为空白对照组，模型对照组，药物对照组及活血通脉灵大剂量治疗组(HXTMLmax)和活血通脉灵小剂量治疗组(HXTMLmin)，采用ISO 复制心肌缺血模型，ABC染色检测VEGF和bFGF表达量。结果空白对照组VEGF、bFGF少量表达，其余各组均有不同程度表达，表达量较空白组高。二者在HXTMLmax组表达量最高，HXTMLmin组次之，与模型组及药物对照组比较差异有统计学意义。结论活血通脉灵能促进缺血心肌表达VEGF，bFGF，有一定的促血管生成作用。

【关键词】  活血通脉灵; 心肌缺血; 异丙肾上腺素; 血管内皮生长因子; 碱性成纤维细胞生长因子

　冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)已成为威胁人类健康的最常见的疾病之一，心肌缺血是该病基本的病理生理过程。目前，对于本病的治疗方法主要有药物治疗、介入治疗、外科手术等，均有其优势和局限性，而促血管生成疗法也是当前一项研究热点，其内容主要为血管内皮生长因子(VEGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)的蛋白治疗和基因治疗。传统的中医药学对于本病在病因病机和辨证治疗等方面也积累了丰富的经验。

　　中药方剂活血通脉灵(HXTML)是以传统气血理论为基础，经多年实践总结出来的具有防治冠心病心肌缺血作用的方剂。本研究采用免疫组织化学法，初步探讨活血通脉灵对异丙肾上腺素(ISO)所致心肌缺血大鼠心肌VEGF, bFGF表达的影响。

　　1 材料与仪器

　　1.1 动物选用Wistar雄性大鼠50只，体质量200～220 g，清洁级，购自河北省实验动物中心，动物合格证编号：DK0505-0027。在通风、温度、湿度适宜的动物室内常规饲养。

　　1.2 药物活血通脉灵(丹参、元胡、柴胡、枳壳、当归、赤芍、川芎、檀香)所需中药材均购自河北医科大学中医院，并由医院制剂室制成汤剂。大剂量组每毫升药液含生药4.7 g，小剂量组每毫升药液含生药2.35 g。盐酸异丙肾上腺素(ISO)注射液：上海禾丰制药有限公司生产，批号：5E20002，规格1 mg/2 ml;肠溶阿斯匹林，石家庄制药集团生产，批号：070617。

　　1.3 试剂VEGF鼠多克隆抗体，批号：11064;生物素标记羊抗小鼠IgG，批号：50481613;bFGF兔多克隆抗体，批号：K1504;生物素标记羊抗兔IgG，批号：50581654;DAB显色剂，批号：41281194。以上试剂均购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.4 仪器电热恒温培养箱：HHB11360型，天津三水科学仪器有限公司产;LEICA切片机RM2125型，德国产;恒温式附贴切片展片仪ZHPY-型，河北医学院提供;双目生物摄影显微镜XSZ-HS型，日本产;高清晰度彩色病理图文分析系统HPIAS-1000型，同济医科大学千屏影象工程公司产。

　　2 方法

　　2.1 动物分组及给药方法采用随机数字表法，将50只Wistar大鼠分为5组，即空白对照组、模型对照组、药物对照组、活血通脉灵大剂量治疗组(HXTMLmax)和小剂量治疗组(HXTMLmin)，每组10只，先适应性喂养7 d。实验前用20%乌拉坦5 ml/kg腹腔注射麻醉后，记录肢体Ⅱ导联心电图，ST段接近等电位线，T波无低平或高耸者即可入选。空白组和模型组每次给予10 ml/kg的生理盐水，药物对照组给予肠溶阿斯匹林16.6 mg/kg，用生理盐水配制成等体积混悬液;活血通脉灵大剂量治疗组和小剂量治疗组分别给予含生药47，23.5 g/kg汤剂, 以上液体及药物的给药容积为10 ml/kg，1次/d，连续14 d。

　　2.2 复制模型方法参照文献[1]，自第12天灌胃后2 h，除空白对照组外，其余4组大鼠均皮下注射异丙肾上腺素5 mg/kg复制心肌缺血模型，空白对照组皮下注射等容积生理盐水，1次/d，连续3 d。

　　2.3 VEGF、bFGF免疫组化染色各组大鼠均在末次皮下注射后45 min取心尖部心肌组织，生理盐水冲洗，40 g·L-1甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，制成4 μm切片，石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH=7.4)冲洗3次，每次3～5 min，每张切片加50 μl过氧化物酶阻断溶液，室温下孵育10 min;PBS冲洗3×5 min;加50 μl的非免疫性动物血清，室温下孵育5 min;分别加50 μl VEGF鼠多克隆抗体(一抗)或bFGF兔多克隆抗体(一抗)，室温下孵育60 min，PBS冲洗3×5 min;分别加50 μl生物素标记的第二抗体(VEGF为羊抗小鼠IgG，bFGF为羊抗兔IgG)，室温下孵育10 min;PBS冲洗3×5 min，加50 μl链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶溶液，室温下孵育10 min;PBS冲洗3×5 min;加100 μl新鲜配制的DAB溶液，显微镜下观察5～10 min;自来水冲洗，中性树胶封固。显微镜下观察，VEGF、bFGF阳性染色表现为心肌细胞胞浆，胞核内散在棕褐色颗粒或团块。根据Weidner法，每个标本选两张片，随机选取10个高倍视野，计数100个同类细胞中的阳性细胞数。

　　2.4 数据处理所有实验数据用±s表示。用SPSS11.5统计软件进行统计处理，不同组间用单因素方差分析。

　　3 结果

　　3.1 VEGF表达空白对照组VEGF少量表达，其余各组均有不同程度表达，表达量较空白组高(P<0.05或P<0.01)。VEGF在活血通脉灵大剂量治疗组表达量最高，小剂量治疗组次之，与模型组及药物对照组比较差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)。药物对照组表达量与模型组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1及图1～5)。

　　3.2 bFGF表达空白对照组bFGF少量表达，其余各组均有不同程度表达，其中模型组与空白组相比表达量较高 (P<0.05)，其余各组表达量显著增高(P<0.01)。活血通脉灵大剂量治疗组及小剂量治疗组表达量高于模型组及药物对照组(P<0.01)，但两组间差异无统计学意义(P>0.05)，药物对照组表达量与模型组间差异无统计学意义(P>0.05)(表1及图6～10)。图1 VEGF在空白对照组大鼠 图2 VEGF在模型对照组大鼠心肌组织中的表达(400×) 心肌组织中的表达(400×)图3 VEGF在药物对照组大鼠 图4 VEGF在活血通脉灵大剂量治疗心肌组织中的表达(400×) 组大鼠心肌组织中的表达(400×)图5 VEGF在活血通脉灵小剂量治疗 图6 bFGF在空白对照组大组大鼠心肌组织中的表达(400×) 鼠心肌组织中的表达(400×)图7 bFGF在模型对照组大鼠 图8 bFGF在药物对照组大鼠心肌组织中的表达(400×) 心肌组织中的表达(400×)图9 bFGF在活血通脉灵 图10 bFGF在活血通脉灵大剂量治疗组大鼠心肌组 小剂量治疗组大鼠心肌组织中的表达(400×) 织中的表达(400×)表1 VEGF和bFGF在各组大鼠心肌组织中阳性表达细胞数的比较

　　4 讨论

　　冠状动脉血管的重建是治疗缺血性心脏病最有效和最根本的方式，经典的方法包括血管溶栓、再通、血管成形、冠状动脉搭桥等。但以上治疗手段只能解决心肌供血问题，却不能修复已坏死的心肌细胞，并且相当一部分患者疗效欠佳或并不适合上述疗法。20世纪末人们提出了血管新生(Angiogenesis)治疗方法，即所谓的“分子搭桥术”，它是指应用药物、基因治疗或其它新治疗手段促进冠脉循环的血管新生，即通过刺激心肌缺血区小血管生长和侧支循环形成,以减轻心肌缺血，防止细胞坏死，预防和延缓缺血性心脏病，改善患者的临床症状和预后。目前，促进缺血心肌区域侧支循环的建立健全和动脉血管的新生，即治疗性血管生成，是国际心血管病学界的研究热点，其主要内容为血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)等的蛋白治疗和基因治疗。