祛疣酊渗漉提取工艺研究
2.2 芍药苷和丹皮酚含量测定[1]
2.2.1 色谱条件 色谱柱：Diamonsil ODS-C18(4.6 mm×150 mm, 5.0 ?m,依利特公司);以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸水溶液为流动相B,按表5进行梯度洗脱;流速1 mL/min,柱温20 ℃;紫外检测波长230 nm;理论塔板数以芍药苷计不低于2 000,以丹皮酚计不低于5 000。分别按照上述色谱条件测定对照品和初试样品,色谱图见图1。表5 梯度洗脱条件注：A.对照品;B.样品;a.芍药苷;b.丹皮酚
图1 袪疣酊HPLC图谱
2.2.2 线性关系考察 分别精密称取芍药苷(4.03 mg)、丹皮酚(5.84 mg)对照品,置100 mL量瓶中,加甲醇至刻度,混匀,得芍药苷和丹皮酚对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液2、3、5、10、12 ?L和2、5、10、15、20 ?L,注入高效液相色谱仪,依上述色谱条件测定峰面积。以色谱峰面积为纵坐标,以芍药苷、丹皮酚的量为横坐标,进行线性回归。结果表明：芍药苷在0.080 6～0.483 6 ?g范围内线性关系良好,回归方程为：Y=1 279.331 08X+2.188 78,r=0.999 93;丹皮酚在0.116 8～1.168 ?g范围内线性关系良好,回归方程为：Y=2 520.113 49X-32.355 70,r=0.999 94。
2.2.3 精密度试验 精密吸取对照品溶液10 ?L,照上述色谱条件重复进样6次,记录色谱峰面积。结果芍药苷峰面积平均值为520.578,RSD=0.38%;丹皮酚峰面积平均值为1 443.525, RSD=0.294 3%。
2.2.4 重复性试验 精密量取同一初试样品6份,每份2 mL,加甲醇稀释至10 mL,混匀,滤过,精密吸取10 ?L,按上述色谱条件测定,并计算芍药苷与丹皮酚的含量。结果每1 g原药材中提取芍药苷的量平均值为4.786 7 mg,RSD=1.44%;每1 g原药材中提取丹皮酚的量平均值为23.385 2 mg,RSD=1.29%。
2.2.5 稳定性试验 取同一初试样品供试品溶液,分别在0、2、5、10、12 h测得芍药苷与丹皮酚峰面积,其峰面积RSD分别为1.35%、0.62%,表明供试品溶液12 h内基本稳定。
2.2.6 加样回收率试验 取已知含量的同一初试样品6份,分别精密加入芍药苷对照品溶液、丹皮酚对照品溶液适量,按“2.1.4”项下方法制得供试品溶液,并按上述色谱条件测定溶液中芍药苷与丹皮酚含量,计算加样回收率。结果芍药苷平均回收率为97.64%,RSD=1.32%;丹皮酚平均回收率为99.97%, RSD=0.99%。
3 讨论
查阅相关文献[4-5],芍药苷和丹皮酚的含量测定多选用250 mm的长柱,本试验选择的色谱条件采用C18 150 mm的短柱,同样能对芍药苷和丹皮酚进行很好的分离,测定方法准确可靠,且出峰时间较快。
在本试验条件下,当芍药苷的进样量大于0.483 6 ?g(12 ?L)时,色谱峰拖尾明显,标准曲线的相关系数降低,可能与色谱柱的载样量有关,有待进一步的试验研究。根据样品中芍药苷的含量,芍药苷进样量在0.080 6～0.483 6 ?g间线性关系良好(r=0.999 93),符合样品含量测定的要求。
本试验进行正交试验综合评价时,考虑到芍药苷和丹皮酚为该方中主要有效成分,其含量对酊剂疗效影响较大,因此,芍药苷和丹皮酚总含量的权重系数以80%计(各占40%);浸膏收率作为间接参考指标,综合评分时权重系数以20%计。
在正交试验条件筛选过程中,以不同的溶媒浓度、溶媒用量、浸泡时间、流速测定了牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的提取率。方差分析表明,乙醇浓度为关键因素,流速、浸泡时间、乙醇用量对提取效果不显著。正交试验结果表明,最佳提取工艺为A2B1C3D1,即药材加6倍量75%的乙醇,浸泡12 h,渗漉速度1 mL/min,在此条件下牡丹皮中芍药苷和丹皮酚的提取率稳定且含量较高。
【参考文献】
[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：化学工业出版社,2005.69,119.
[2] 黄建猷,刘智生,黄瑞松.正交实验法优选乳康酊渗漉提取工艺研究[J].中国实验方剂学杂志,2007,13(11)：19-20.
[3] 杨 瑜,方世平,肖从新.正交实验法优选赤芍的渗漉提取工艺[J].医药导报,2005,24(5)：433-434.
[4] 潘 莹,郭小龙,陈 勇.HPLC法测定杞菊地黄丸中马钱苷、芍药苷和丹皮酚的含量[J].中国药科大学学报,2007,38(2)：133-135.
[5] 周 欣,杨文业.高效液相色谱法测定丹栀逍遥丸中栀子苷、芍药苷、丹皮酚和甘草酸含量[J].药物分析杂志,2005,25(7)：784-787.