甲泼尼龙对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠SRp30c的影响
作者：危智盛，王晓辉，洪铭范，苏全喜，余青云，臧林泉，潘雪刁
【摘要】 目的 研究不同剂量甲泼尼龙(MP)作用于实验性变态反应性脑脊髓炎(EAE)大鼠模型后，剪接因子SRp30c的表达及其与疗效的关系，探讨MP治疗作用及发生激素抵抗的可能机制。方法 构建Wistar大鼠EAE模型，将EAE大鼠分成大剂量组、小剂量组、模型对照组，分别通过尾静脉注射MP 100 mg/kg、25 mg/kg、等容量生理盐水;另取未造模大鼠作为正常对照组，予等容量生理盐水注射。给药5d后处死大鼠，提取新鲜脊髓组织行RTPCR，检测SRp30c mRNA表达，分析其与疗效的关系。结果 SRp30c在各组均有表达，大、小剂量组SRp30c mRNA表达明显高于模型组、正常对照组，差异有显著性;不同大鼠Kono评分改善的差值与其SRp30c mRNA表达值呈负相关(r=-0.583，P<0.05)。结论 SRp30c表达与病情及MP剂量无直接关系，但与疗效呈负相关，表明其与糖皮质激素敏感性下降有着密切的关系，EAE模型发生激素抵抗的机制中SRp30c扮演着重要的角色。
【关键词】 甲泼尼龙 实验性变态反应性脑脊髓炎 糖皮质激素抵抗 SRp30c
Abstract:Objective To investigate the expression of alternative splicing factor SRp30c and the therapeutic effect of methylprednisolone (MP) and the correlation between SRp30c and the therapeutic effect in experimental allergic encephalomyelitis (EAE) in rats after treatment with MP at different doses,and to explore the possible mechanisms of glucocorticoid resistance. Methods Established EAE model with Wistar rats and the animal model were divided into three groups (highdose group,lowdose group,and model control group). Highdose group and lowdose group were treated by intravenous injection MP through caudal vein at the doses of 100 mg/kg and 25 mg/kg respectively. Model control group and another normal control group were administered with normal saline at the same volume. The rats were executed after 5day therapy,then the spinal cord was extracted and used to detect the expression of SRp30c mRNA by reverse transcription polymerase chain reaction. The relationship between SRp30c and the therapeutic effect was studied. Results SRp30c was expressed in every group. The expression level of highdose group and lowdose group were significant higher than that of model and normal control group. There was linear correlation between the expression of SRp30c mRNA and the GN score changes (r=-0.583，P<0.05). Conclusion There was neither direct correlation between the expression of SRp30c and pathogenesis,nor the dose of MP. While it had a negative correlation between SRp30c and therapeutic effect. Therefore,it suggested that SRp30c contributed to the declining sensitivity of glucocorticoid,and it might play an important role in the mechanisms of glucocorticoid resistance in EAE.
Key words:methylprednisolone;experimental allergic encephalomyelitis;glucocorticoid resistant;SRp30c
多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种常见的中枢神经系统白质脱髓鞘病变，临床对于MS急性发作和复发常首选甲泼尼龙(methylprednisolone，MP)冲击治疗。然而，MP使用的剂量一直存在争议，现常用的有500，1 000，2 000 mg/d。超大剂量能否提高疗效及有无诱导糖皮质激素(glucocorticoid，GC)抵抗，引起临床关注。糖皮质激素抵抗(glucocorticoid resistant)发生机制非常复杂，其中剪接因子家族中SRp30c与激素抵抗密切相关[1，2]。本研究通过对实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis，EAE)大鼠模型MP治疗后神经组织中SRp30c mRNA表达情况进行分析，探讨MP治疗作用及MS发生激素抵抗的可能机制。
广东药学院学报 第25卷 第3期 危智盛，等.甲泼尼龙对实验性变态反应性脑脊髓炎大鼠SRp30c的影响1 材料与方法
1.1 实验材料
Wistar雌性大鼠，体质量180～200 g;豚鼠，体质量350～400 g，均购自南方医科大学实验动物中心(许可证号：Scxk粤20060015);不完全弗氏佐剂购自Sigma公司;卡介苗冻干粉、百日咳菌液购自中国药品生物制品检定所;总RNA提取试剂Trizol Reagent(Invitrogen公司);逆转录试剂盒(Toyobo公司);甲泼尼龙(Pfizer Manufacturing Belgium NV公司)。
1.2 EAE模型制备[3]
以豚鼠全脊髓制成无黏性50%(V∶V)髓鞘碱性蛋白(MBP)生理盐水匀浆。将卡介苗冻干粉与不完全弗氏佐剂混匀，配成卡介苗浓度为4 mg/mL的完全弗氏佐剂。再将MBP匀浆与等体积的完全福氏佐剂混合，反复抽打成油包水样，制成抗原乳剂。戊巴比妥钠腹腔麻醉Wistar大鼠后在大鼠四肢足垫分别注入抗原乳剂共0.4 mL，并在大鼠左后肢足背皮下注射0.1 mL百日咳菌液(约含3×109个菌体)。免疫接种后每天观察大鼠反应、进食、体质量、行动等情况。依据Kono[4]标准对神经损害症状进行评估：正常或无任何神经缺损症状，记0分;I级：尾部肌张力消失，可见轻度步态笨拙，记1分;Ⅱ级：尾部无力，双后肢肌张力低，记2分;Ⅲ级：尾部无力，双后肢瘫痪，但给予刺激后可挪动，记3分;IV级：瘫痪累及前肢，伴尿便失禁，记4分;V级：濒死状态或死亡，记5分。症状介于两标准级之间以±0.5分记。
1.3 实验分组及给药
EAE发病大鼠随机分成3组，分别为：①大剂量组8只，予MP 100 mg/kg;②小剂量组8只，予MP 25 mg/kg;③模型对照组7只，予等容量生理盐水;另取5只未经造模的Wistar大鼠同等条件下饲养作为正常对照组，予等容量生理盐水。造模后第12天，大鼠发病达高峰时开始给药。MP以生理盐水稀释后自尾静脉缓慢注入，每日给药1次，连续3 d后均减半量再给药2 d，共给药5次。
1.4 组织取材
各组给药5 d后，于第6天进行评分后处死，取大鼠部分新鲜脊髓组织置液氮保存，备作总RNA提取。另取大脑视交叉层面2 mm脑组织、小脑、脑干、脊髓颈膨大、腰膨大部分4%多聚甲醛固定做常规石蜡包埋、切片、HE染色，光镜下观察脑、脊髓组织的形态学变化。
1.5 RTPCR
新鲜脊髓组织研磨制成Trizol匀浆，异硫氰酸胍苯酚氯仿一步法提取总RNA,紫外分光光度法测定RNA的量和纯度。cDNA合成及PCR扩增反应体系均按试剂盒说明进行。引物由Invitrogen公司合成，SRp30c引物序列：sense:5′TTCTAA ACACAGTGGGCGACTC3′,antisense:5′TACGTAATT TCGACCAGAGCCA3′, 产物199 bp; 内参 G3PDH序列：sense:5′ACCACAGTCCATGCCATCAC3′,antisense:5′TCCACCACCCTGTTGCTGTA3′，产物450 bp。PCR产物与loading buffer混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳，紫外透射分析仪观察后成像，Qantity one凝胶图像分析系统测定SRp30c及G3PDH的吸光度，计算SRp30c/G3PDH值，作为SRp30c mRNA的表达水平。
1.6 统计学处理
采用SPSS13.0统计软件进行分析，首先对数据做正态性检验，计量资料以±s表示。若符合正态分布，两组间用t检验;多组间参数比较采用单因素方差分析;多组均数两两比较采用LSDt检验分析;相关关系采用Pearson相关分析。