细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析
2 结 果
2.1 发酵液中小分子有机酸的紫外吸收特性
大多数有机酸在200 nm以上无吸收或吸收很小，用间接紫外检测时其背景电解质吸收要求尽可能低。缓冲溶液中硼砂的紫外吸收较低，因此试验了硼砂溶液的紫外吸收特性。图1、图2分别为各种有机酸标准样品和背景电解质硼砂的紫外吸收光谱。结果表明：当波长小于220 nm时，大多数有机酸都有紫外吸收;当波长小于210 nm时，背景电解质的紫外吸收增加很快，影响有机酸的测定。综合考虑，选择214 nm作为检测波长，在该检测波长处常见有机酸都有比较理想的吸收值。
2.2 电渗流改性剂对分离的影响
有机酸阴离子的电泳方向与电渗方向相反，通常加入阳离子表面活性剂使电渗反向，从而与有机酸阴离子的电泳方向一致，以缩短分析时间。因此本实验在缓冲液中加入0.5 mmol/L的CTAB作为电渗流改性剂。实验发现，在未加CTAB之前，5种有机酸在20 min内才能得到分离，加入CTAB后时间缩短到5 min。
2.3 最佳反应体系的建立
2.3.1 缓冲液浓度的选择 在大多数情况下，随着缓冲液浓度的增加，离子强度增加，电渗流速度降低，溶质在毛细管内的迁移速率下降，迁移时间延长。而且随着缓冲液浓度的增加，导电的离子数增加，在相同的电场强度下毛细管的电流值增大，焦耳热增加。实验考察了不同浓度的硼砂对分析物的影响，分离结果见图3。结果表明，当硼砂浓度从10 mmol/L 增加到20 mmol/L 时，保留时间呈上升趋势;当浓度大于20 mmol/L时，保留时间有所下降;在20 mmol/L时，保留时间最长。为保证体系的稳定性，节约分离时间，提高检测灵敏度，选择10 mmol/L为硼砂缓冲液的最佳浓度。
2.3.2 缓冲液pH值的选择 缓冲溶液pH值的调节与控制是优化分离的重要因素。有机酸为弱酸，其pKa值大多在2～6之间。分析物的电离度依赖于电解质溶液pH值的变化，电离度的不同引起电泳淌度和电渗流淌度的差异，进而影响分离效率和电泳迁移行为。由于在酸性介质中有机酸易被毛细管壁吸附，因而通常在碱性环境下实现分离。本研究选择pH 9.0～11.0进行实验，分离结果见图4。从图可见，当pH为10.5时，5种有机酸均可完全分离;随着pH的增大，分离度进一步得到改善，但同时使分离时间延长。综合考虑分离度、分离时间和灵敏度，选定硼砂缓冲液的最佳pH为10.5。
2.3.3 分离电压的选择 电压是控制柱效、分离度和分析时间的重要因素。分离电压的变化会引起电场强度的改变，进而影响组分的分离。本研究分别考察了电压在10～25 kV范围内的分离效果，结果见图5。结果表明，随着电压的增大，柱效提高，因而有机酸的分析时间缩短。但过高的电压会产生较大的焦耳热，导致区带展宽，峰面积下降，从而影响分离效率和分离度。综合比较不同电压下的分离图谱，发现在20 kV条件下各种有机酸均得到良好的分离而且保留时间适合，峰形也最好。
2.3.4 分离柱温的选择 柱温对电解质溶液的黏度、谱带扩展、离子淌度等有直接的影响。柱温试验发现：15～35 ℃区间的不同柱温下分离时间变化不大,但对各种有机酸的分离度有较大影响。在柱温为30 ℃时，各种有机酸的分离都能较好满足工作需要，因此选择30 ℃作为实验柱温。
2.3.5 最佳反应体系 综合以上各个优化条件，最终选用的毛细管分析体系为：214 nm为检测波长，10 mmol/L (含0.5 mmol/L CTAB)的硼砂作为缓冲溶液，pH值为10.5，分离电压为-20 kV，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s。
2.4 各种有机酸标准样品的定性与定量
将各种单一有机酸液依次进样，记录各自的保留时间：甲酸为2.68 min，乙酸为3.02 min，丙酸为3.13 min，丁酸为3.25 min，乳酸为3.47 min。
以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(同一批次每个样品平均进样3次取平均值，系列实验重复6次)，以有机酸浓度为横坐标、峰面积为纵坐标作图，建立标准曲线，计算相关系数并建立回归方程，见表1。从表1中的线性回归方程可知，在实验样品的浓度范围内，各种有机酸的线性关系良好，用该种方法定量准确度可以得到保证。
2.5 有机酸混合样品的分析
配制有机酸标准品混合液,根据已确定的各项实验参数进行分析,电泳分析图谱见图6。通过积分计算峰面积，再返回标准曲线对照，得出各种有机酸的含量及样品回收率和检测精密度，见表2。表1 有机酸工作曲线的特征参数表2 有机酸标准品混合液中各有机酸的含量及回收率
3 讨 论
毛细管电泳自问世以来，主要用于药品、氨基酸、核酸等物质的分离检测。从本文结果可见，在利用毛细管电泳进行分离分析时，缓冲液的种类、浓度、pH值和分离电压、柱温都对分离有重要的影响。适量电渗流改性剂CTAB的加入明显增进电迁移速率，缩短分离的时间。缓冲液的pH值对分离的影响最大，pH值不仅影响色谱峰的形状和有机酸样品的保留时间，更重要的是，不适合的pH条件根本不能使各有机酸得到分离。分离电压的提高主要是影响到有机酸的保留时间，同时如果过高电压导致产生的焦耳热也会影响峰形。实验表明所建立的方法简单、快速、准确、重复性好，适用于发酵过程中代谢产物的监控及发酵过程工艺参数的优化。
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