RPHPLC法测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量
【摘要】 目的 建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的方法。方法 采用反相高效液相色谱法：色谱柱为UltimateTMAQC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，以甲醇水(体积比45∶55)为流动相，流速1 mL/min，柱温 30 ℃，检测波长274 nm。结果 丹皮酚的质量浓度在1.024～25.60 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好(r=0.999 0，n=5),平均回收率103.3%，RSD为1.5%。 结论 该方法准确、专属性强、重复性好，可用于测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚的含量。
【关键词】 光合细菌 六味地黄汤 丹皮酚
六味地黄汤由宋代名医钱乙首创，是中医著名的滋补肾阴传统代表方剂，由熟地、山茱萸、山药(三补)和泽泻、丹皮、茯苓(三泻)所组成[1]，主治肾阴不足证，从古到今在中医临床广为应用[2]。本实验室在前期研究中，探索性地将光合细菌引入到经典方剂六味地黄汤中，利用光合细菌自身的营养成分及其生物转化功能，达到提高药效的目的。药理实验结果表明，六味地黄汤经光合细菌代谢后，在增强免疫、抗衰老[3]和治疗肾阴虚证模型小鼠等方面的作用均优于传统的六味地黄汤[4]。本文建立测定六味地黄汤生物制剂中丹皮酚含量的RPHPLC法，为进一步有效控制其质量提供实验依据。
1 仪器与试药
1.1 仪器
Waters高效液相色谱仪; Water 2996 PDA检测器;Empower数据工作站;DL360A超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);RE-52A旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂生产);SH-2DCⅢ循环水试真空泵(巩义市英峪义予华仪器厂);BP211D电子天平(德国sartorius)。
1.2 试药
丹皮酚对照品(批号110708200505，中国药品生物制品检定所);缺丹皮六味光合液、六味光合液(实验室自制);PSB液(活菌数109个/mL，暨南大学水生生物研究所提供)，甲醇(色谱纯)，无水乙醇、三氯甲烷(分析纯)，自制双重蒸馏水。
2 方法与结果
2.1 溶液的制备
2.1.1 对照品溶液的制备 取丹皮酚对照品1.3 mg，精密称定，置50 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，制成质量浓度为25.60 μg/mL的对照品溶液，密封保存，备用。
2.1.2 样品溶液的制备 取一定量六味地黄汤生物制剂的样品溶液，调pH值至2，精密量取20 mL，加入20 mL无水乙醇，超声30 min，3 000 r/min离心10 min，滤过，取上清液，即得。
2.1.3 阴性对照溶液的制备 取不含有牡丹皮光合细菌代谢的缺味六味地黄汤样品溶液，按“2.1.2”项方法制得阴性对照品溶液。
2.2 色谱条件与系统适应性试验
色谱柱为UltimateTM AQC18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇水(体积比45∶55)，流速为1 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长274 nm，进样量10 μL。取PSB溶液、阴性对照品溶液、对照品溶液与供试品溶液各10 μL进样，结果表明，丹皮酚色谱峰分离度良好，理论塔板数以丹皮酚计算不低于3 000，分离度大于1.5，阴性对照品无干扰，见图1。
2.3 线性关系的考察
精密吸取“2.1.1”项对照品溶液1.0、5.0、10.0、15.0、25.0 mL置25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，分别制得质量浓度为1.024、5.120、10.240、15.360、25.600 μg/mL的对照品溶液，分别进样10 μL，在“2.2”项色谱条件下，测定丹皮酚的峰面积。以质量浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归，得回归方程为Y=97278X-19986,r=0.999 0，表明丹皮酚质量浓度在1.024～25.60 μg/mL范围内与峰面积具有良好线性关系。