细菌代谢产物中小分子有机酸的高效毛细管电泳分析
作者：胡耀华,钟文彬,周林,黄树林
【摘要】 目的 建立高效毛细管电泳法测定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸的分析方法，测定细菌代谢产物中的小分子有机酸。方法 采用毛细管：Beckman coulter未涂层50 μm×60 cm (有效长度50 cm);缓冲溶液：pH 10.5的10 mmol/L(含0.5 mmol/L CTAB)的硼砂溶液;检测波长214 nm，分离电压-20 kV，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s。结果 4 min内甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、乳酸得到基线分离。线性范围分别为：甲酸3.8～30.7 mg/L (r=0.997 1);乙酸3.3～52.5 mg/L (r=0.996 1);丙酸3.1～49.5 mg/L (r=0.999 3);丁酸3～48 mg/L (r=0.992 5);乳酸7.5～60.5 mg/L (r=0.999 5)。平均回收率分别为: 甲酸99.29%(RSD=0.67%);乙酸98.90%(RSD=1.36%);丙酸99.65%(RSD=0.65%);丁酸99.35%(RSD=0.42%);乳酸98.06%(RSD=1.44%)。结论 该方法简单、快速、准确，可用于细菌发酵液中代谢产物有机酸的检测。
【关键词】 细菌代谢产物 小分子有机酸 高效毛细管电泳
Abstract:Objective To establish a method for determining formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid in bacterial metabolites by the highperformance capillary electrophoresis. Methods Samples were analyzed on a Beckman Coulter (50 μm ×50 cm) uncoated fusedsilica capillary using 10 mmol/L borate buffer ( pH 10.5,containing 0.5 mmol/L CTAB). The UV detection wavelength was 214 nm,the separation voltage -20 kV and injection pressure 1.0 psi×10 s. Results Standard samples of formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid were separated well in 4 minutes,and their linear ranges were 3.8-30.7 mg/L (r=0.997 1),3.3-52.5 mg/L (r=0.996 1),3.1-49.5 mg/L (r=0.999 3),3.0-48.0 mg/L(r=0.992 5),7.5-60.5 mg/L (r=0.999 5),respectively,their average recoveries were 99.29%,98.90%,99.65%,99.35% and 98.06%,respectively. The RSD values (n=6) of formic acid,acetic acid,propionic acid,butyric acid and lactic acid were 0.67%,1.36%,0.65%,0.42%,1.44%,respectively. Conclusion The method is simple,rapid and accurate for detecting the organic acids in bacterial metabolites in fermentation liquor.
Key words:metabolic product;organic acid;highperformance capillary electrophoresis
代谢流量是细胞生理学的一个基本决定因素，也是代谢途径中最重要的参数。对细菌进行代谢流量分析，特别是代谢产物中小分子有机酸的分析，有助于通过基因工程手段定向地、有目的地改变限制细胞代谢的关键途径，以更好地理解和利用细胞代谢进行化学转化、能量转导和活性产物表达[1]。在发酵过程中，产酸发酵细菌能将有机物转化为以脂肪酸和醇为主的末端产物，同时生成新的细胞物质。产酸发酵速率较快，末端产物主要有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸、乳酸等脂肪酸以及醇类(乙醇等)、二氧化碳、氢气、氨、氮气等[2]。通过分析这些发酵末端产物可以了解细菌的代谢途径，而代谢通量的分析可以使所需要的一些关键操作单元协调运行，从而达到副产物最小而产率最优的目的[3]。
毛细管电泳(CE)是一类以毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力的新型液相分离分析技术，具有效率高、分离检测样本的速度快、所需要的样本和试剂少、检测的模式多且可以和其他技术联用、试剂易得廉价、能够实现自动化的优点，越来越广泛地被用于有机酸的分析[4]。影响有机酸分离的主要因素有：缓冲溶液的种类、缓冲溶液的pH 值、电渗流改性剂和添加剂、分离电压等。本研究建立了CE法(区带电泳分离模式)测定小分子有机酸的方法，并对缓冲溶液的种类、pH值以及添加剂等对电泳分离条件进行了研究，从而为研究细菌的代谢途径提供技术手段。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
高效毛细管电泳仪：Beckman Coulter P/ACE MDQ毛细管电泳系统(32KaratTM Software ver 5.0) ，毛细管为Beckman Coulter未涂层50 μm ×60 cm (有效长度50 cm)。甲酸、乙酸(Sigma公司，色谱纯)，丙酸、丁酸、乳酸(Sigma公司，分析纯)，四硼酸钠、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)(广州市化学试剂厂，分析纯)。所有溶液均用超纯水配制和稀释，标准样品和缓冲液经0.22 μm滤膜过滤后进样。
1.2 方法
1.2.1 毛细管电泳环境的平衡 每次进样前毛细管先用水洗3 min，再用0.1 mol/ L的NaOH溶液冲洗3 min，水洗3 min，然后再用缓冲液冲洗5 min。每次更换试样时均用缓冲液清洗5～10 min，所需时间以基线平稳为准。
1.2.2 检测波长的选择 以190～250 nm为检测波长，检测各种有机酸和运行缓冲液的紫外吸收特性，选择各有机酸吸光度相对较大、而缓冲液吸光度相对较小的波长为检测波长。
1.2.3 缓冲液浓度的选择 采用214 nm检测波长，分离电压-20 kV，进样压力为1.0 psi，进样时间为10 s，在pH值为10.5的情况下，评价 10～25 mmol/L的硼砂缓冲体系。
1.2.4 缓冲液pH的选择 分别以pH 9.0、pH 9.5、pH 10.0、pH 10.5、pH 11.0的缓冲溶液进行分离，各有机酸分别进样，以缓冲液pH值对各有机酸的保留时间作图。
1.2.5 分离电压的选择 分别以10、15、20、25 kV为分离电压进行分离，各有机酸分别进样，以分离电压对各有机酸的保留时间作图。
1.2.6 分离温度的选择 分别以15、20、25、30、35 ℃为分离温度进行分离，各有机酸分别进样，以分离柱温对各有机酸的保留时间作图。
1.2.7 各种有机酸标准样品的定性和定量 将各种单一有机酸液依次进样,记录各自保留时间。以上述优化结果为实验条件，5种不同浓度有机酸从低浓度至高浓度依次进样，计算各自的峰面积(每个样品平均进样3次)，以有机酸浓度对峰面积作图,建立标准曲线。
1.2.8 有机酸混合样品的分析 配制不同浓度的有机酸标准混合液进行定量分析，积分计算峰面积，比较计算值与实际值的误差，得出样品回收率和检测精确度，论证分析方法的准确性和重复性[5]。