正常和6羟多巴胺毁损大鼠脚桥核神经元对胆碱能M受体刺激的反应
作者：李小颖，向莉，尤雪梅，惠艳娉，李立博，侯辰，张巧俊
【摘要】 目的 在体水平上观察选择性胆碱能M受体激动剂氧化震颤素(OxoM)对正常和6羟基多巴胺(6OHDA)毁损大鼠脚桥核(PPN)神经元自发电活动的影响。方法 采用玻璃微电极细胞外记录和PPN内注射OxoM，观察PPN神经元电活动的变化。结果 与正常组大鼠相比，6OHDA毁损组大鼠PPN神经元的平均放电频率增高(P<0.01)，神经元活动趋于不规则(P<0.001);PPN内注射OxoM对正常组和6OHDA毁损组大鼠的PPN神经元放电频率均可产生升高、降低和无变化三种改变。然而，PPN内注射OxoM对正常组大鼠PPN神经元的平均放电频率无明显影响，但OxoM使6OHDA毁损组大鼠PPN神经元的平均放电频率显著降低(P<0.001)。结论 胆碱能M受体激动剂抑制损毁组大鼠PPN神经元的活动，其作用机制是复杂的，涉及到PPN内突触前和突触后胆碱能受体。
【关键词】 脚桥核;M型胆碱能受体;氧化震颤素;帕金森病;电生理学
ABSTRACT: Objective To explore the effects of oxotremorine M (OxoM), muscarinic acetylcholine receptor agonist, on spontaneous firing rate of neurons of pedunculopontine nucleus (PPN) in normal and 6hydroxydopamine (6OHDA)lesioned rats.Methods Change in the firing activity of PPN neurons was observed by extracellular recording in vivo and local injection of OxoM in the PPN.Results The results showed that the mean firing rate of PPN neurons in the lesioned rats was significantly increased compared to that in normal rats (P<0.01), and that the firing pattern of the neurons changed toward a more irregular firing after the lesion (P<0.001). IntraPPN injection of OxoM induced increase, decrease or no change in the firing rate of PPN neurons in both the normal and 6OHDAlesioned rats. However, the mean firing rate of PPN neurons in normal rats remained unaltered by the stimulation of M receptors, but the mean firing rate of PPN neurons in the lesioned rats decreased significantly by intraPPN injection of OxoM (P<0.001). Conclusion M receptor agonist inhibits the activity of the PPN neurons in lesioned rats; the action mechanism of the agonist is complicated, involving not only postsynaptic but also presynaptic M receptors located in different sites within the PPN.
KEY WORDS: pedunculopontine nucleus; M acetylcholine receptor; oxotremorine; Parkinsons disease; electrophysiology
脚桥核(pedunculopontine nucleus, PPN)是一中脑的神经结构，由胆碱能和非胆碱能神经元组成[1]。解剖学和电生理学研究表明PPN与基底神经节有丰富的交互纤维联系，在运动调控中起重要作用[1]。PPN的主要传入纤维包括来自黑质网状部(substantia nigra pars reticulate, SNr)和脚内核(endopeduncular nucleus, EP)的γ氨基丁酸能神经纤维，以及来自底丘脑核(subthalamic nucleus, STN)和额叶皮质的谷氨酸能神经纤维[12]。PPN的上行传出纤维主要投射到黑质致密部(substantia nigra pars compact, SNc)、STN、EP、苍白球、纹状体和丘脑;下行传出纤维主要投射到延髓[12]。
研究表明在帕金森病(Parkinsons disease, PD)动物模型中PPN神经元的电活动显著增强[3]。最近研究发现在6羟基多巴胺(6hydroxydopamine, 6OHDA)毁损的PD模型大鼠中，PPN内细胞色素氧化酶mRNA的表达量增加[4]。这些研究结果提示了黑质纹状通路损毁后PPN处于过度活动状态。另外，原位杂交研究显示PPN神经元上有胆碱能M2、M3和M4受体亚型的表达，且M2受体表达的密度最高[5]。然而，在正常和PD状态下PPN内M受体的功能尚不清楚。因此，本研究采用玻璃微电极细胞外记录法，观察了PD模型大鼠PPN神经元电活动的变化，以及PPN内微量注射选择性胆碱能M受体激动剂氧化震颤素(oxotremorine M, OxoM)对正常和PD模型大鼠PPN神经元活动的影响，旨在探讨M受体在正常和PD状态下在PPN 神经元活动中的作用。
1 材料与方法
1.1 动物和药物 实验选用成年、雄性SD大鼠，体重220～260g，由西安交通大学实验动物中心提供。动物分笼饲养，每笼5只，自由摄食饮水，24h昼夜循环光照。实验所用药物地昔帕明、6OHDA、OxoM和盐酸阿朴吗啡均购自美国Sigma公司。地昔帕明、阿朴吗啡和OxoM均溶于无菌生理盐水;6OHDA溶于含0.1g/L抗坏血酸的生理盐水中。
1.2 PD模型的制备 在注射6OHDA前30min，先给大鼠注射地西帕明(25mg/kg，i.p.)以保护去甲肾上腺素能神经元。大鼠用40g/L水合氯醛(300mg/kg，i.p.)麻醉后将其头部固定于脑立体定位仪上(SN2N，Narishige，日本)，根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧SNc的坐标位置：前囟后4.9～5.3mm，矢状缝右侧1.8～2.2mm，硬脑膜下7.2～7.4mm[6]。微量注射使用尖端与玻璃微电极相连的10μL微量注射器，分两点在SNc内注射6OHDA，每个注射位点给予2μL 6OHDA溶液(2g/L)，总量2g/L。注射完后留针5min，然后缓慢退出玻璃微电极。术后两周进行阿朴吗啡诱导的旋转实验，给大鼠注射阿朴吗啡(0.05mg/kg，s.c.)，大鼠在5min内向损毁侧的对侧旋转超过20圈，表明造模成功[3,7]。
1.3 电生理记录及放电形式分析 电生理记录在SNc损毁后第3周进行，整个实验过程监测大鼠心率，肛温维持在(37±0.5)℃。大鼠用200g/L乌拉坦麻醉(1.2g/kg，i.p.)后固定于脑立体定位仪上，采用在体玻璃微电极细胞外记录法记录PPN神经元放电，电极尖端直径1～2μm，阻抗10～20MΩ，充灌液为0.5mol/L的醋酸钠，含20g/L滂胺天蓝。根据大鼠脑立体定位图谱确定右侧PPN的位置：前囟后7.3～8.3mm，矢状缝右侧1.6～2.0mm，硬脑膜下6.2～7.2mm[6]。神经元放电经微电极放大器(MEZ8201, Nihon Kohden，日本)，显示于记忆示波器上(VC11, Nihon Kohden，日本)，神经电信号经CED1401 Spike2(Cambridge Electronic Design，英国)采集和分析。
根据放电间隔直方图(interspike interval histogram, ISIH)，并结合原始放电序列，将神经元的放电形式分为以下3种类型：①规则放电：ISIH呈对称分布;②不规则放电：ISIH呈随机不对称分布;③爆发式放电：ISIH呈逐渐衰减的正偏态分布。每一个ISIH的生成最少包含500个连续的动作电位，bin宽4ms。另外，根据ISIH计算出平均放电间隔的变异系数。变异系数是放电间隔的标准差与平均放电间隔之比，反映神经元电活动的规则程度[3,7]。
1.4 局部给药 PPN内微量注射使用与1μL微量注射器相连接的玻璃微电极，微电极尖端直径约50μm。将给药微电极和记录微电极固定于微电极操纵器上，调整两个电极使其尖端的位置非常接近(小于0.4mm)。核团内微量注射药物或盐水的剂量均为200nL，约3min注完。一般情况下，微量注射的机械作用会引起神经元的放电幅度降低，这种作用约持续1min。因此，在统计数据时，微量注射后1min内的放电活动不予计算。每个神经元在给药前记录5min自发放电作为前对照，给药1min后记录5～10min以观察给药后神经元电活动的变化。与前对照相比，放电频率的改变超过20%则认为有显著性变化。每只大鼠只观察1个神经元对药物的反应。
1.5 组织学及免疫细胞化学 电生理记录完毕后，通过玻璃微电极电泳滂胺天蓝(-20μA，15min)标记最后一个记录位点。大鼠在过量麻醉后，经心脏灌注生理盐水，随后用40g/L多聚甲醛灌注固定;取脑后固定4h;再将鼠脑置于含200g/L蔗糖的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline, PBS)中过夜;连续冠状冰冻切片，片厚40μm，行尼氏染色以确定记录神经元的位置。
为确认多巴胺能神经元的损毁程度，将大鼠SNc的脑片行酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase, TH)染色[7]。先将脑片在室温条件下置于含3g/L TritonX100中30min;然后置于含30g/L牛血清蛋白的PBS中室温30min;接着加入一抗(1∶800，Chemicon，美国)，在4℃条件下孵育48h;加入生物素标记的二抗(1∶200，Chemicon，美国)室温孵育2h;再加入抗生物素蛋白生物素过氧化物酶复合物(1∶100，Vector，美国)室温孵育2h;
最后将脑片置于含0.1mL/L H2O2的0.5g/L DAB显色剂中室温下显色5～10min。除加入一抗外，其他步骤之间均需漂洗。最后，将脑片裱于明胶处理过的载玻片上，待自然干燥后，常规酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。显微镜下行TH阳性细胞计数。在6OHDA毁损组，只有注射侧SNc内TH阳性神经元完全或几乎完全缺失的大鼠进行电生理资料统计。
1.6 数据统计与分析 两组间或组内放电频率的比较采用Students t检验，PPN神经元对OxoM不同反应的百分比及神经元放电形式的比较采用χ2检验。平均放电间隔和变异系数的比较采用MannWitney U检验。所有数据均以
±s或对照的百分比表示。定义P<0.05为显著性差异的标准。
2 结 果
尼氏染色结果证实，所有正常和6OHDA毁损组大鼠通过滂胺天蓝电泳标记的记录位点均位于PPN内(图1A)。本研究中的6OHDA毁损组大鼠在阿朴吗啡诱导旋转实验中均表现出恒定的向损毁侧的对侧旋转，且5min内旋转圈数均超过20圈[34±3(圈/5min)]，这些大鼠在TH染色后毁损侧SNc内多巴胺能神经元均完全消失(图1B)。
2.1 正常组和6OHDA毁损组大鼠PPN神经元的电活动 在正常组的28只大鼠中，PPN神经元放电频率的变化范围是1.0～19.3spikes/s，平均为(8.1±1.1)spikes/s(n=28，图2A)。平均放电间隔为(263±71)ms，平均变异系数为0.37±0.05(图2B、2C)，大多数PPN神经元(61%)呈现出规则放电，32%的神经元为不规则放电，7%的神经元为爆发式放电(图2D)。在6OHDA损毁组的33只大鼠中，PPN神经元放电频率的变化范围是1.2～49.7spikes/s，平均放电频率为(13.1±2.2)spikes/s，与正常组相比明显增加(n=33，P<0.01;图2A)。平均放电间隔
图1 6OHDA损毁大鼠脚桥核内标记的记录位点和TH免疫组化染色显示6OHDA注射侧黑质致密部内多巴胺能神经元完全变性