他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞ABCA1基因表达的影响
作者：宫惠琳，李扩，张冠军，侯惠莲，董炜疆
【摘要】 目的 观察他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞ATP结合盒式转运体1(ATPbinding cassette transporter 1, ABCA1)基因表达的影响。方法 培养人类神经细胞和神经胶质细胞，分别加入不同浓度的辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀(pravastatin)，孵育不同时间后分别提取细胞总RNA和胞质蛋白，RTPCR观察ABCA1基因的表达，Western blot检测ABCA1蛋白。结果 辛伐他汀和普伐他汀组显著降低了ABCA1基因和蛋白的表达，其中辛伐他汀的作用比普伐他汀明显(辛伐他汀对神经元和神经胶质细胞ABCA1基因表达分别降低95%和75%P<0.05)，神经元实验组比神经胶质细胞组更为敏感。结论 他汀类药物可以显著降低神经元和神经胶质细胞ABCA1基因和蛋白的表达，ABCA1的降低有可能影响细胞内胆固醇的代谢，对全面评价他汀类药物对高血脂相关基因的影响及用药安全性提供了一定的实验依据。
【关键词】 ATP结合盒式转运体1;辛伐他汀;普伐他汀
ABSTRACT: Objective To observe the effects of statins on ATPbinding cassette transporter 1 (ABCA1) gene expression in neurons and astrocytes.Methods Primary human astrocytes and neuron cell line HCN2 were incubated with simvastatin and pravastatin at different concentrations and under different conditions. Using RNA isolated from the cultured cells, we performed quantitative PCR to measure the ABCA1 gene expression in astrocytes and neurons. The protein expression of ABCA1 was measured by Western blot.Results The two statins significantly decreased the ABCA1 gene and protein expressions. Compared with pravastatin, simvastatin significantly reduced the expression of ABCA1 in neurons and astrocytes by 95% and 75%, respectively (both P<0.05). The neurons were more sensitive than astrocytes.Conclusion The statins are capable of decreasing the ABCA1 gene and protein expressions in neurons and astrocytes, and decreased ABCA1 expression may affect cholesterol metabolism in cells. The results may provide an important experimental basis for comprehensive evaluation of the statins to treat hyperlipidemia.
KEY WORDS: ATPbinding cassette transporter 1 (ABCA1); simvastatin; pravastatin
他汀类药物是临床常用的一类降血脂药物[12]，其主要成分为胆固醇合成限速酶羟甲戊二酰辅酶A(HMGCoA)还原酶的抑制剂。辛伐他汀(simvastatin)和普伐他汀(pravastatin)已广泛应用于高血脂症的临床治疗。由于该药阻断甲羟戊酸的生化途径，不但能抑制胆固醇的合成、降低血浆LDL的水平、阻止巨噬细胞向泡沫细胞的转化，而且可以显著降低因高血脂引起的动脉粥样硬化性疾病的死亡率[3]。此外，研究表明，他汀类药物还可以升高血浆高密度脂蛋白
(high density lipoprotein, HDL)和载脂蛋白A。
ATP结合盒式转运体1(ATPbinding cassette transporter 1, ABCA1)是ATP结合盒式转运蛋白之一，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用。ABCA1基因错义突变所引起的杂合子型Tangier疾病，就是由于apoA I所介导的胆固醇流出减少、HDLC浓度降低和颗粒直径变小而造成[4]。作为潜在的抗粥样硬化的靶点之一，上调ABCA1基因的表达具有重要意义。apoA I是HDL中主要的蛋白质，是细胞胆固醇逆向转运的特殊重要因素。apoA I能与磷脂、多种血浆因子及细胞膜受体结合, 可以激活卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)，起着促进细胞内胆固醇的移出、酯化、转移、以及调节HDL代谢的作用[5]。
以往学者认为，他汀类药物可能对老年痴呆症有一定的预防作用[6]。但是，近年来有关他汀类药物可能导致老年痴呆症或者加重原有症状的报道越来越多[79]。目前，有关他汀类药物对中枢神经系统ABCA1基因的影响还未见报道。本实验通过观察辛伐他汀、普伐他汀对正常神经细胞和神经胶质细胞中ABCA1基因表达的影响，初步解释了他汀类药物有可能造成患者老年痴呆症的发生或者症状加重的原因，为进一步揭示他汀类药物的作用机制及其与神经系统退行性疾病的关系打下一定的基础。
1 材料与方法
1.1 材料 神经细胞系HCN2(CRL10742)购自美国ATCC公司，神经胶质细胞系为本实验室保存。辛伐他汀、普伐他汀、甲羟戊酸、FPP和GGPP均购自SIGMA公司。RNA提取试剂盒购自美国QIAGEN公司。MemPER真核细胞膜蛋白提取试剂盒购自美国Pierce公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养 常规培养神经元和神经胶质细胞，分别用含有150mL/L和50mL/L胎牛血清的DMEM培养基进行培养，待细胞汇合成片，胰酶消化后分别转入12孔板内，放入50mL/L CO2培养箱中37℃培养观察，待细胞生长成片时，用不含血清的培养基分别配置5μmol/L的辛伐他汀、20μmol/L普伐他汀、100μmol/L甲羟戊酸、10μmol/L的FPP、10μmol/L GGPP，充分混匀。分别设立空白对照组、辛伐他汀实验组(S)、普伐他汀实验组(P)、辛伐他汀+甲羟戊酸实验组(SM)、普伐他汀+甲羟戊酸实验组(PM)、辛伐他汀+FPP实验组(SF)、普伐他汀+FPP实验组(PF)、辛伐他汀+GGPP实验组(SG)、普伐他汀+GGPP实验组(PG)。放入培养箱继续培养48h。
1.2.2 逆转录反应 离心收集细胞，预冷PBS洗涤1次后用QIAGEN试剂盒提取细胞总RNA。取1μg细胞总RNA，5×逆转录缓冲液5μL，RNasin(40u/μL)20u，10mol/L 4×dNTPs 2μL，用DEPC处理的H2O补足至23μL。混合均匀后于70℃反应5min，加入2μL反转录酶，37℃反应1h后，90℃热灭活5min，置-20℃贮存备用。
1.2.3 荧光定量RTPCR检测ABCA1的表达 采用
ABI PRISM 7700 Sequence detector荧光定量PCR仪，以18S为内参。反应体系如下：吸取逆转录反应产物5μL，上、下游引物各10pmol/L，荧光探针5pmol/L，5×PCR缓冲液10μL，10mol/L 4×dNTPs 1μL，Taq DNA聚合酶1.5μL(2u/μL)，用灭菌纯水补足至50μL，在PE7000(美国ABI公司)上，93℃预变性3min后按如下条件进行循环：93℃ 30s，55℃ 45s，72℃ 20s，共40个循环。设置阴性对照和阳性梯度对照，实验结果由电脑软件分析。引物序列如下，F：5′TGGTTCTATGCCCGCTTGA3′;R：5′ACCTTAGATCCCCCGACAAAG3′。
1.2.4 Western blot方法测定神经元和神经胶质细胞中ABCA1蛋白的变化 离心收集细胞，预冷PBS洗涤1次后，用MemPER真核细胞膜蛋白提取试剂盒提取细胞膜蛋白。采用BioRad公司的垂直电泳装置电泳，并用半干法转膜。杂交按照KPL公司的Protein Detector T Western Blot Kit说明进行。ABCA1一抗购自NOVUS公司。
1.3 统计学处理 所有实验数据以
±s表示，使用Statistica软件(美国，StatSoft Inc)分析。采用MannWhitney U检验和t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
宫惠琳，李 扩，张冠军，等. 他汀类药物对神经细胞和神经胶质细胞ABCA1基因表达的影响