舒肝健脾补肾方对慢性应激肝郁模型妊娠大鼠、胎鼠宫内发育的干预作用
作者：朱姝，王希浩，张爱华，黄保民
【摘要】 目的研究舒肝健脾补肾中药对慢性应激肝郁模型孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平及胎鼠、胎盘重量的影响，探讨肝郁影响生殖功能的机理及舒肝健脾补肾中药的作用机理。方法复制孕鼠慢性应激肝郁模型，将60只孕鼠随机分为5组：正常组、模型组、舒肝健脾补肾高组、舒肝健脾补肾低组、滋肾育胎丸组。孕19 d剖宫取胎，放射免疫法测定孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2的含量，用免疫组化法检测子宫蜕膜PR水平。结果模型组孕鼠血清P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平及胎鼠、胎盘重量较正常组明显降低(P﹤0.01)。舒肝健脾补肾高组血清P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平及胎鼠、胎盘重量明显高于模型组(P﹤0.01)。舒肝健脾补肾低组与与模型组相比无明显差异(P﹥0.05)。结论舒肝健脾补肾方能提高慢性应激肝郁模型胎鼠、胎盘的重量。能提高孕鼠血清IGF-1、IGF-2的水平、P水平、子宫蜕膜PR水平。研究结果为临床运用舒肝健脾补肾法治疗肝郁型胎儿宫内发育迟缓提供了理论依据。
【关键词】 肝郁模型; 舒肝健脾补肾方; 胎儿宫内发育迟缓
胎儿宫内发育迟缓是指胎儿出生体重低于同孕龄胎儿平均体重的两个标准差或第10百分位数，是围产儿发病和死亡的主要危险因素之一,还可影响儿童期和青年期发育，影响人口素质[1]。胎儿宫内发育迟缓应属于祖国医学的“胎萎不长”“胎不长”“妊娠胎萎燥”。中医学认为，肝主疏泄，调畅情志。情志不遂，疏泄失职，致肝气郁结，而肝气郁结可致气滞、血淤、痰湿，可影响脾肾功能，导致肝脾肾同病，胎失所养，胎萎不长。
本研究通过建立妊娠大鼠慢性应激肝郁动物模型，并以舒肝健脾补肾方药进行干预。实验过程中，观察孕鼠的自主行为，测定P、IGF-1、IGF-2、子宫蜕膜PR水平、胎鼠体重、胎盘重量，从中医肝郁角度探讨胎儿宫内发育迟缓的机理，研究舒肝健脾补肾中药对慢性应激肝郁状态下妊娠大鼠及胎儿宫内发育的影响，从而揭示肝郁影响生殖功能的机理及舒肝健脾补肾中药的作用机理。
1 材料与仪器
1.1 实验动物分组Wistar雌性大鼠60只，体质量(240±30)g(购自河南省实验动物中心)。按2∶1比例雌雄鼠合笼。每天进行阴道脱落细胞涂片，直到见到大量云片状上皮细胞中夹有大量精子作为妊娠第1天。将孕鼠随机分为5组：即正常对照组(简称正常组)、模型对照组(简称模型组)、舒肝健脾补肾高剂量组(简称舒肝健脾补肾高组)和舒肝健脾补肾低剂量组(简称舒肝健脾补肾低组)、滋肾育胎丸组(简称阳性药组)，每组12只。
1.2 药材按原方剂量40倍取材制剂。舒肝健脾补肾方：柴胡360 g，制香附360 g，生白芍600 g，苏梗360 g，黄芩360 g，党参600 g，炒白术600 g，熟地1200g，杞子600 g，生山药1 200 g，菟丝子1200g，川断480 g，寄生480 g。滋肾育胎丸：购自广州中一药业有限公司。国药准字Z44120018，批号：070806。所得制剂浓度分别相当于生药含量的3.82，0.242 g/ml，由河南省中医药研究院制剂室提供。批号：20070810。
1.3 试剂及器材P、IGF-1放免试剂盒(购自天津九鼎医学生物工程有限公司)。IGF-2放免试剂盒(购自解放军总医院科技开发中心放免研究所提供)。敞箱(自制)：高为50 cm，长宽均为80 cm,周壁为黑色，底面用白线划分为面积相等的25块。束缚筒(自制)：束缚筒直径为6 cm，长为16 cm。制动箱(自制)：长为40 cm，宽为30 cm，高为30 cm。程控穿梭箱：DCS-2，医科院药研所制。电子秤：EB-2800M，LIBROR。离心沉淀机：LXJ-II，上海医用分析仪器厂。石蜡切片机：Leit2，德国。摊片烤片机：HG3003-3，南京电器三厂制造。微波炉：格兰仕，800W。光学显微镜：GALEN-II3696，BAUSCH LOMB。双目显微镜(自动照相)：BHA，日本。全自动γ-放射免疫计数器：FJ-20089，南京。
2 方法
2.1 动物模型的建立 按文献法[2～5]，对模型组及药物干预组孕鼠进行慢性心理应激实验。孕鼠接受的应激包括：(1)束缚筒束缚，2h/次，3次/d。(2)程控穿梭箱声-电刺激，刺激参数为①声：强度为65 dB，每循环持续60 s，3循环/次，9循环/d;②电：足底电击电流强度为3 mA，每循环持续65 s，3循环/次，9循环/d。连续刺激至动物处死，应激实验环境与饲养环境分开，正常组孕鼠不给予刺激，孕鼠受刺激后出现尖叫、直立、挠腮、撕咬、蜷缩、饮食减少、大便稀薄、体重下降，提示肝郁模型建立。
2.2 给药剂量与方法正常组给予蒸馏水灌胃，10 ml/kg，1次/d,连续18 d。模型组造模后给予蒸馏水灌胃，10 ml/kg，1次/d，连续18 d。舒肝健脾补肾高剂量组造模后给予舒肝健脾补肾方浸膏稀释液灌胃，13.12 g/ kg·d，相当于成人剂量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，连续18天。舒肝健脾补肾低剂量组造模后给与舒肝健脾补肾方浸膏稀释液灌胃，6.56 g/k g·d，相当于成人剂量的6.7倍，10 ml/kg，1次/d，连续18d。滋肾育胎丸组：造模后常规饲养,给予滋肾育胎丸稀释液灌胃，2.42 g/ kg·d，相当于成人剂量的13.4倍，10 ml/kg，1次/d，连续18 d。
2.3 检测指标及方法
2.3.1 一般状态及自主活动的观察 分组后，开始仔细观察和记录各组孕鼠体重及自主活动情况，并作出造模前后孕鼠的体重及自主活动情况变化对比。在心理应激刺激前后，分别进行开放场地实验(敞箱试验，Open-field test，OFT):将受试大鼠放在OFT中心区域，同时开始记录3min内孕鼠穿越格数(以三足踏入同一格为准)，以及孕鼠直立(双前肢离地)次数[6～8]。每只动物仅进行1次测定，3min/次。
2.3.2 阴道上皮脱落细胞的观察大鼠合笼后，每天早上8点进行阴道上皮脱落细胞的观察。将沾有生理盐水的棉签轻柔旋人母鼠的阴道(0.5 cm)，旋转一圈以后拿出,再将棉签上沾有的阴道内分泌物涂于清洁的玻片上。稍干，用95%水乙醇固定3～5 min，HE染色，风干。在200×普通光学显微镜下观察，1次/d，直到见到大量云片状上皮细胞中夹有大量精子作为妊娠第1天。
2.3.3 血清的测定在妊娠第19天时断头处死孕鼠,取血4～5 ml，静置分层、离心、分离血清，将分离血清储存于-70℃冰箱内。用放射免疫分析法测定P、IGF-1、IGF-2，由河南省中医药研究院放免室检测，按试剂盒说明书操作。
2.3.4 子宫蜕膜PR水平的检测将4%多聚甲醛液固定的子宫，常规脱水，浸蜡、包埋，切片厚度5 μm。由河南省肿瘤医院病理实验室检测，严格按照PR免疫组化试剂盒说明书操作。免疫组化法判断标准：每张切片在 200 ×光镜下观察 5 个视野，阳性染色为细胞核或细胞浆内出现棕黄色颗粒。阳性细胞表达占 10～30%为 “+ ”，占50%以上为“+++”，在两者之间为“++”;阴性表达：未见阳性或阳性细胞占5%以下，表达为“-”。
2.3.5 胎鼠、胎盘重量在妊娠第19天时断头处死孕鼠，解剖取出胎鼠、子宫、胎盘进行称重。
2.4 统计学处理所有数据均采用SPSS 13.0软件进行统计处理，计量资料结果以±s描述;符合正态分布计量资料多组间比较用单因素方差分析，两两比较采用q检验，不符合正态分布的采用对数法或倒数法进行转换为正态资料后进行统计分析，多个独立样本非参数检验用等级频数资料分析。