青春期龈炎下菌斑中牙龈卟啉单胞菌kgp基因的调查分析

【关键词】  龈炎   牙周斑   基因型   牙龈卟啉单胞菌
        牙龈蛋白酶是一种由牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis, Pg）产生和分泌的蛋白酶，它与持续的Pg感染、牙龈炎症、肿胀、出血倾向、龈沟液的产生及牙周组织破坏等病理过程密切相关，其中牙龈蛋白酶K(gingipains k,Kgp)是最有潜能的纤维蛋白降解酶。曾有报道青春期龈炎下菌斑中的Pg具有相对的Kgp基因型，为评估青春期龈炎的P.gingivalis特异Kgp基因型的发生率，揭示其与牙周疾病严重程度间有无相关关系，从而为牙周疾病的预防提供信息，现做了以下调查分析。
        1  资料与方法
        1.1 调查对象及分组  病例选自中通化卫生学校的新生，年龄14～18岁。青春期龈炎的诊断依据：青春期个体，唇侧龈缘及牙周乳头肿胀，探诊易出血，牙龈指数（gingival　index,GI）≥1，但附着水平无改变。试验分两组，青春期龈炎组36例，牙龈健康组（GI＝0）36人，每组男女比例为1：1。入选标准：①全身系统性疾病；②近期3个月内未服用免疫制剂和抗生素；③无正畸及牙周治疗史④无吸烟史。所有调查究对象均之情同意。
        1.2 牙周临床检查  在采集菌斑之前，检查并记录每例被检查者上、下颌的第一磨牙与切牙（指数牙，同时也为菌斑采样牙）的GI、龈沟出血指数（sulcusbleeding index,SBI）及探诊深度(probe depth,PD)，分别取其平均值。
        1.3 Pg分离培养和DNA提取  对每例被检查者上下颌的第一恒磨牙与切牙，用无菌刮匙自信去除龈上菌斑后，棉卷隔湿，吹干，用龈下刮匙插入龈沟底采集龈下菌斑，将采集的菌斑混合，放入200μl厌氧装运夜中，室温下涡旋振荡器震荡30s分散菌斑。将分散的细菌溶液10倍梯度稀释。取100μl稀释液接种于5mg/L氯化血红素，10mg/L维生素K1和5%无菌脱纤维羊血的BHI培养基（Gibco,美国)，厌氧培养5～7d。根据菌落的形态特征和革兰氏染色结果，挑取可疑Pg分离培养3d。增菌后-70℃保存备检。酚-氯仿抽提法提取细菌DNA。
        1.4 16SrRNA  PCR法鉴定龈下菌斑中的Pg。
        1.5 PCR法扩增编码  KGP催化域的基因片段;引物序列及反应条件Beikler等设计，扩增片段长度为792bp，由上海生物工程有限公司合成。利用Abiprism310序列自动分析仪进行PCR产物测序，结果进行局部序列相似性检索（basic localalignment search tool， BLAST）。 

        1.6 Kgp基因的检测（酶切电泳） 酶切体系20μl，包括PCR产物15μl，限制性内切酶Mse I（New England公司，英国）0.5μl，10倍NEB缓冲液2μl，灭菌ddH2O2.3μl,37℃24h.于2.0%琼脂糖凝胶（含0.5mg/L溴化乙锭）上100V电泳40min，300nm紫外灯下观察并照相。以100bpDNA ladder为相对分子质量标准（大连宝生物公司）。根据PCR产物酶切后的长度变化读出基因。
        1.7 统计学分析  结果用SPSS 11.5软件包进行分析。用秩相关检验分析Kgp的酶活性及表达强度与各牙周指数之间的关系。以P＜0.05为差异有统计学意义。